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摘 要： 摘要:目的建立一種超臨界流體色譜方法拆分調(diào)血脂藥阿托伐他汀鈣與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，并對(duì)對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定。方法采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2色譜柱(3.0mm150mm，2.5m)，以超臨界二氧化碳/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)為流動(dòng)相，背壓為13.8MPa
摘要:目的建立一種超臨界流體色譜方法拆分調(diào)血脂藥阿托伐他汀鈣與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，并對(duì)對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定。方法采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2色譜柱(3.0mm×150mm，2.5μm)，以超臨界二氧化碳/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)為流動(dòng)相，背壓為13.8MPa，進(jìn)樣量為4μL，柱溫為45℃，流速為1.5mL·min-1，于244nm波長(zhǎng)處分離阿托伐他汀鈣及其對(duì)映異構(gòu)體。結(jié)果阿托伐他汀鈣與其對(duì)映體在5min內(nèi)均已出峰完全，分離度達(dá)4.1，對(duì)映體在2.5～50μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999(n=6)。對(duì)映體的檢測(cè)限與定量限分別為1.0μg·mL-1(S/N=3)和2.5μg·mL-1(S/N=10);阿托伐他汀鈣原料藥中對(duì)映異構(gòu)體的平均加樣回收率為100.40%。結(jié)論利用超臨界流體色譜分離阿托伐他汀鈣手性雜質(zhì)與使用普通液相色譜相比可極大縮短分離時(shí)間，減少有機(jī)溶劑的使用量，重現(xiàn)性好，可有效用于阿托伐他汀鈣的質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞:阿托伐他汀鈣;對(duì)映體雜質(zhì);超臨界流體色譜;手性拆分
阿托伐他汀鈣是一種調(diào)血脂藥，是HMG-CoA還原酶的選擇性及競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可有效降低純合子家族性高膽固醇血癥患者的低密度脂蛋白水平[1]。《英國(guó)藥典》2017版(BP2017)、《歐洲藥典》9.0版(EP9.0)、《美國(guó)藥典》40版(USP40)均收載阿托伐他汀鈣，均制定了對(duì)映體雜質(zhì)檢查項(xiàng)，《中國(guó)藥典》2015年版未收載此藥。阿托伐他汀鈣結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)手性中心，藥理活性成分為阿托伐他汀鈣(R，R)型，結(jié)構(gòu)式見圖1，其余3個(gè)異構(gòu)體均為雜質(zhì)，其中非對(duì)映異構(gòu)體(R/S，S/R)在國(guó)外藥典有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)條件下可與其他雜質(zhì)同時(shí)實(shí)現(xiàn)分離，而對(duì)映異構(gòu)體(S，S)型(對(duì)映體)則采用正相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測(cè)。
超臨界流體色譜(SFC)以超臨界流體做流動(dòng)相，因具有較強(qiáng)的溶解能力，及良好的傳質(zhì)能力，可利用其溶劑化能力來進(jìn)行分離分析。SFC兼具氣相色譜和液相色譜的特點(diǎn)，相比普通液相而言能獲得更快更好的分離分析效率，在難以實(shí)現(xiàn)快速良好分離的中藥成分和手性藥物中均有較大優(yōu)勢(shì)[2-3]。SFC采用二氧化碳作流動(dòng)相最大的局限性在于無法分離極性大的化合物，有些無法洗脫的化合物需通過加入改性劑和少量添加劑來實(shí)現(xiàn)分離洗脫。目前有報(bào)道采用高效液相分離阿托伐他汀鈣及對(duì)映體[4-5]，分離時(shí)間達(dá)數(shù)十分鐘，而采用SFC進(jìn)行快速手性拆分的方法尚沒有報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)擬采用超臨界流體色譜法結(jié)合手性固定相對(duì)阿托伐他汀鈣及其對(duì)映體雜質(zhì)進(jìn)行拆分，并對(duì)原料藥中對(duì)映體的量進(jìn)行定量測(cè)定。
1儀器與試藥
WatersAcquityUltraPerformanceConvergenceChromatography(UPC2)系統(tǒng)，光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)。BP211D型精密天平(Sartorius公司)。Trefoil系列色譜柱如下:ACQUITYUPC2TrefoilCEL1，ACQUITYUPC2TrefoilCEL2，ACQUITYUPC2TrefoilAMY1，3根色譜柱規(guī)格相同(3.0mm×150mm，2.5μm)。甲醇、乙醇、乙腈、三氟乙酸均為色譜純。二氧化碳(純度99.99%)。
阿托伐他汀鈣對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100590-201303，純度95.3%)，阿托伐他汀鈣對(duì)映體雜質(zhì)對(duì)照品(EDQM，批號(hào):Y0001332)，阿托伐他汀鈣消旋體混合物對(duì)照品[RANBAXY，B.NO:SYK(D-716)36，Chromatographicpurity:98.5%，Chiralpurity:Enantiomer44.1%，Atorvastatin55.9%]。阿托伐他汀鈣原料藥3批:2批由BSMsinochem(LotNo:3141400240，3141400257)提供，1批由RANBAXYLaboratories(LotNo:2743173)提供。
2方法與結(jié)果
2.1溶液的配制
2.1.1對(duì)照品溶液精密稱取對(duì)映體雜質(zhì)對(duì)照品2.5mg于25mL量瓶中，加甲醇5mL振搖溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1的對(duì)映體儲(chǔ)備液。精密量取適量用乙醇稀釋制成10μg·mL-1的對(duì)映體對(duì)照品溶液。
2.1.2系統(tǒng)適用性溶液精密稱取阿托伐他汀鈣對(duì)照品30mg于10mL量瓶中，加乙醇少量振搖溶解后精密加入對(duì)映體儲(chǔ)備液1mL，用乙醇稀釋至刻度，制成含阿托伐他汀鈣3.0mg·mL-1，對(duì)映體雜質(zhì)10μg·mL-1的系統(tǒng)適用性溶液。
2.1.3供試品溶液精密稱取3批阿托伐他汀鈣原料適量，加少量甲醇溶解后用乙醇定量稀釋混勻制成每1mL含3.0mg的溶液，作為供試品溶液。
2.2色譜條件及系統(tǒng)適用性
色譜柱篩選初始色譜條件為:流動(dòng)相為CO2/甲醇(80/20，V/V);流速:1.0mL·min-1;背壓:13.8MPa;柱溫40℃;進(jìn)樣量:1μL;檢測(cè)波長(zhǎng):244nm。測(cè)定色譜條件為:色譜柱采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2(3.0mm×150mm，2.5μm);流動(dòng)相為CO2/0.1%TFA-甲醇(78/22，V/V);流速為1.5mL·min-1;背壓為13.8MPa;柱溫45℃;進(jìn)樣量4μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm。
取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣4μL，色譜圖見圖2，阿托伐他汀鈣與其對(duì)映體分離度為4.19。
2.3檢測(cè)限與定量限
精密量取“2.1”項(xiàng)下對(duì)映體對(duì)照品溶液，進(jìn)行逐級(jí)定量稀釋，進(jìn)樣量4μL，以信噪比S/N分別為3和10計(jì)算，檢測(cè)限為1.0μg·mL-1，定量限為2.5μg·mL-1。
2.4線性與范圍
精密量取“2.1”項(xiàng)下對(duì)映體儲(chǔ)備液，用乙醇定量稀釋制成含對(duì)映體分別為2.5、5.0、8.0、12.5、25.0、50.0μg·mL-1的線性溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣4μL，記錄色譜圖，以對(duì)映體峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ρ，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，對(duì)映體在2.5～50μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=4404.1ρ-2273.1，r2=0.9999(n=6)。
2.5日內(nèi)與日間精密度
對(duì)含對(duì)映體分別為低(5.0μg·mL-1)、中(10.0μg·mL-1)、高(50μg·mL-1)3個(gè)濃度的對(duì)映體溶液進(jìn)行日內(nèi)(n=6)和日間精密度(d=3，n=6)考察，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，日內(nèi)精密度低、中、高3個(gè)濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.14%、0.89%和2.03%，日間精密度低、中、高3個(gè)濃度RSD分別為2.28%、0.82%和2.01%。
2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)
取系統(tǒng)適用性溶液分別于配制后0、1、3、5、8、12h測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，阿托伐他汀鈣峰面積RSD為2.72%，對(duì)映體峰面積的RSD為1.87%，對(duì)映體占阿托伐他汀鈣峰面積百分比的RSD為1.30%(n=6)，表明溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7供試品測(cè)定
取兩家企業(yè)的3批原料藥按“2.1”項(xiàng)下方法配制，每批平行制備3份，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，均未檢出對(duì)映體，色譜圖見圖3。
2.8回收率試驗(yàn)
精密稱取同一批號(hào)(2743173)原料藥9份，每份約相當(dāng)于阿托伐他汀鈣30mg，分別置于10mLFig.3SFC-PDAChromatogramofatorvastatincalciumcrudedrug(Lot.2743173)量瓶中，分為3組，每組各加入對(duì)映體儲(chǔ)備液0.60、0.90和1.20mL(其中0.90mL加入量參照《歐洲藥典》中的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)限度0.3%計(jì)算)，加乙醇振搖溶解，稀釋至刻度。按供試品測(cè)定項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。平均回收率為100.40%，RSD為1.91%(n=9)。
3討論
3.1色譜柱的選擇
取少量消旋體對(duì)照品用甲醇溶解，在“2.2”項(xiàng)色譜柱篩選初始色譜條件(流動(dòng)相為CO2/甲醇(80/20，V/V);流速:1.0mL·min-1;背壓:13.8MPa;柱溫40℃;進(jìn)樣量:1μL;檢測(cè)波長(zhǎng):244nm)下對(duì)3根手性色譜柱AMY1[直鏈淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、CEL1[纖維素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、CEL2[纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)]進(jìn)行考察，固定相結(jié)構(gòu)見圖4。結(jié)果顯示，在AMY1和CEL1色譜柱上目標(biāo)物質(zhì)在15min內(nèi)出峰，但主峰與異構(gòu)體雜質(zhì)峰完全重合無法分離，在CEL2色譜柱上目標(biāo)物質(zhì)在10min內(nèi)出峰且主峰與雜質(zhì)峰完全分離，分離度達(dá)4.6，見圖5。推測(cè)原因可能是固定相對(duì)溶質(zhì)的立體選擇性。手性固定相中最重要的手性吸附位置為氨基甲酸酯部位，阿托伐他汀鈣中手性中心上的羥基可與固定相上的氨基或羰基形成氫鍵，根據(jù)空間位置的差異從而實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別，AMY1和CEL1中固定相上的苯環(huán)引入推電子基團(tuán)甲基時(shí)，會(huì)使羰基活性增強(qiáng);而CEL2中苯環(huán)上引入吸電子基團(tuán)氯時(shí)會(huì)使氨基活性變高，從結(jié)構(gòu)上觀察推測(cè)阿托伐他汀鈣手性中心上羥基與固定相上羰基作用時(shí)的空間位阻比其與氨基作用時(shí)大，從而使阿托伐他汀鈣在CEL2上的手性識(shí)別能力比在AMY1和CEL1上好。最終選擇色譜柱CEL2進(jìn)行后續(xù)條件優(yōu)化。
3.2溶劑的選擇
考察甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇4種溶劑對(duì)阿托伐他汀鈣測(cè)定的影響，結(jié)果表明，阿托伐他汀鈣在甲醇中溶解，在乙醇中微溶，在乙腈和異丙醇中不溶;對(duì)映體在甲醇中溶解，在乙醇中微溶。但因阿托伐他汀鈣用甲醇溶解放置20h后，在主峰相對(duì)保留時(shí)間0.86處會(huì)產(chǎn)生一未知降解雜質(zhì)，見圖6。綜合考慮阿托伐他汀鈣與對(duì)映體在溶劑中的溶解度與穩(wěn)定性，最終選用少量甲醇作為溶解溶劑用于樣品粉末的初步溶解，選用乙醇作為稀釋溶劑用于樣品溶解后的定量稀釋。相比EP9.0和BP2017中先分別用甲醇溶解對(duì)映體、無水乙醇/甲醇(50/50)溶解供試品后用無水乙醇稀釋、正己烷定容的制備步驟，本實(shí)驗(yàn)選取的制備步驟更簡(jiǎn)便。
3.3流動(dòng)相的優(yōu)化
二氧化碳臨界溫度31℃，臨界壓力7.29×106Pa，對(duì)溫度、壓力有寬的選擇范圍，是最易獲得的超臨界流體之一，且對(duì)各類有機(jī)分子溶解性較好。在二氧化碳中添加改性劑可改善分離的選擇性。分別以體積分?jǐn)?shù)20%的異丙醇、乙腈、乙醇、甲醇為改性劑，在其他色譜條件相同的情況下，以甲醇為改性劑時(shí)，可獲得良好分離度，選擇甲醇為改性劑進(jìn)一步優(yōu)化比例與添加劑。嘗試在改性劑中加入微量添加劑三氟乙酸，可使峰寬變窄，保留時(shí)間縮短。當(dāng)以CO2/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)為流動(dòng)相，背壓為13.8MPa，柱溫為40℃，流速為1.5mL·min-1時(shí)，阿托伐他汀鈣與對(duì)映體可獲得良好峰形與分離度，綜合考慮保留時(shí)間、分離度，選擇上述條件作為流動(dòng)相。相比USP40、BP2017和EP9.0中采用正己烷-無水乙醇-三氟乙酸(940∶60∶1，V/V/V)作流動(dòng)相，文獻(xiàn)[4]中采用正己烷-無水乙醇-三氟乙酸(93∶7∶0.1，V/V/V)作流動(dòng)相，本實(shí)驗(yàn)采用的流動(dòng)相配制更簡(jiǎn)便，相同流速條件下有機(jī)溶劑使用量減少75%以上，更綠色環(huán)保。
3.4背壓、流速、柱溫與進(jìn)樣量的優(yōu)化
分別考察了1.0、1.2、1.5mL·min-1的流速，35、40、45℃的柱溫，13.8、15.2和17.2MPa的背壓對(duì)分離結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，提高流速對(duì)峰分離度沒有顯著影響且可以使保留時(shí)間提前，改善峰形;背壓對(duì)保留時(shí)間、分離度及峰形的影響均不顯著;溫度升高，峰寬減小，信噪比增加。綜合考慮最終選用1.5mL·min-1的流速，13.8MPa的背壓和45℃的柱溫作為最終分離條件。
本實(shí)驗(yàn)考察了不同進(jìn)樣量對(duì)阿托伐他汀鈣與對(duì)映體的峰形影響，取系統(tǒng)適用性溶液在優(yōu)化后的色譜條件下分別進(jìn)樣1、2、3、4、5μL，結(jié)果表明，在進(jìn)樣量加大至5μL情況下會(huì)出現(xiàn)超載現(xiàn)象，色譜圖中主峰與對(duì)映體峰峰形均較差，因此在不發(fā)生超載的前提下為盡可能提高檢測(cè)靈敏度，選擇進(jìn)樣量為4μL。
4結(jié)論
采用此超臨界流體色譜方法對(duì)不同企業(yè)的3批進(jìn)口原料藥進(jìn)行測(cè)定，均未檢出對(duì)映體。建立的方法可在4min內(nèi)完成阿托伐他汀鈣與對(duì)映體雜質(zhì)的完全拆分與雜質(zhì)的測(cè)定，相比文獻(xiàn)[4-5]中采用正相色譜條件約40min的拆分方法，此方法具有分離時(shí)間短，分離效率高，樣品配制與操作簡(jiǎn)便，有機(jī)試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，從進(jìn)樣到完成分離的過程中采用此方法的有機(jī)溶劑使用量?jī)H為國(guó)外藥典標(biāo)準(zhǔn)條件中有機(jī)溶劑使用量的3%左右，實(shí)現(xiàn)了超臨界流體色譜在分析技術(shù)領(lǐng)域中綠色環(huán)保的理念，為阿托伐他汀鈣中對(duì)映體雜質(zhì)的質(zhì)量控制和研究提供更快更有效的選擇。
相關(guān)期刊推薦：《中國(guó)藥學(xué)雜志》創(chuàng)刊于1953年，是由中國(guó)藥學(xué)會(huì)主辦的我國(guó)藥學(xué)界創(chuàng)刊最早，反映我國(guó)藥學(xué)各學(xué)科發(fā)展和動(dòng)態(tài)最具權(quán)威性、影響力的，發(fā)行量最大的綜合性學(xué)術(shù)核心期刊之一。以發(fā)表高水平學(xué)術(shù)論文及學(xué)術(shù)交流動(dòng)態(tài)為主，面向國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行，年發(fā)行量達(dá)24萬余冊(cè)，已經(jīng)成為全國(guó)各大醫(yī)院、藥店、醫(yī)藥企業(yè)、科研院所和大專院校的臨床醫(yī)生(55%)、藥劑師(20%)、生產(chǎn)、銷售、高級(jí)科研及相關(guān)行政人員必備指導(dǎo)性期刊。有投稿需求的，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。