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摘 要： 摘要背景：組織工程骨為修復極限骨缺損提供了新的選擇，但只有先形成完善的功能性血管網，保證穩定的成骨和骨整合，才能取得良好的治療效果。因此，血管化可以說是組織工程骨面臨的最大挑戰與難題。目的：探討體外聯合應用血管內皮生長因子(vascularendothel
摘要背景：組織工程骨為修復極限骨缺損提供了新的選擇，但只有先形成完善的功能性血管網，保證穩定的成骨和骨整合，才能取得良好的治療效果。因此，血管化可以說是組織工程骨面臨的最大挑戰與難題。目的：探討體外聯合應用血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和血小板衍生生長因子BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)對骨髓間充質干細胞增殖和成血管能力的影響。方法：體外分離培養SD大鼠骨髓間充質干細胞，分別用不同質量濃度VEGF(20，40，60，80，100，120μg/L)、PDGF-BB(20，40，60，80，100，120μg/L)聯合干預以及100μg/LVEGF單獨干預、100μg/LPDGF-BB單獨干預，CCK-8實驗檢測2種細胞因子促進細胞增殖的最佳質量濃度，然后在第7天和第14天通過RT-PCR方法檢測血管生成素1、缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子等相關成血管基因的表達量。結果與結論：①加入生長因子后，細胞增殖能力明顯提高，聯合作用效果更優，最佳組合為80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB;②VEGF、PDGF-BB都可以促進血管生成素1、缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子的mRNA表達，聯合應用時效果最佳;③缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子mRNA表達隨時間延長有所升高，差異有顯著性意義(P<0.05);而血管生成素1、胰島素樣生長因子mRNA表達量隨時間延長有所降低，差異有顯著性意義(P<0.05);④體外實驗結果證明，當VEGF和PDGF-BB質量濃度均為80μg/L時，能夠持續穩定促進整個血管形成過程，且促進作用優于單獨一種生長因子。
關鍵詞：骨髓間充質干細胞;血管內皮生長因子;血小板衍生生長因子BB;組織工程骨;血管化
0引言Introduction
口腔頜面部大段骨缺損修復一直是口腔臨床治療的難題[1]。組織工程骨的問世為修復極限骨缺損提供了新的選擇，然而在臨床應用過程中，只有先形成完善的功能性血管網克服擴散限制[2]，保證穩定的成骨和骨整合，才能取得良好的臨床治療效果[3]。因此，血管化可以說是組織工程骨面臨的最大挑戰與難題[4]。血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是目前促血管生成能力最強的生長因子，多位學者研究發現單獨大劑量使用外源性VEGF時可有效促使內皮細胞通過芽生方式連結為血管內膜腔，但是其促生的血管結構較為幼稚，缺乏成熟血管的基底膜和周細胞[5]。血小板衍生生長因子BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)是強力促分裂劑，作用于管周細胞，能促進血管成熟[6]。二者單獨作用都對血管化起推動作用，然而聯合使用研究較少，且對于聯合應用后相互拮抗還是相互促進用，一直存在爭議[7];另一方面，聯合應用生長因子促進成血管時，其合適的比例及作用濃度也非常重要[8]。
期刊推薦：《分子細胞生物學報》是1936年由中國科學院、上海生命科學研究院等單位主辦的期刊。主要刊登分子細胞生物學領域,包括細胞生物學、發育生物學、生殖生物學、腫瘤生物學和免疫生物學等方面的創新性研究論文、研究簡報和特約綜述等,為中國自然科學核心期刊之一。
該研究聯合應用不同質量濃度VEGF和PDGF-BB對骨髓間充質干細胞進行培養，旨在研究二者對骨髓間充質干細胞增殖及成血管的影響，并確定最佳質量濃度組合，希望能夠誘導產生更加成熟穩定的血管網，遴選更加優質的組織工程骨種子細胞。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計隨機對照細胞實驗。
1.2時間及地點實驗于2017年12月至2019年5月在新疆醫科大學第一附屬醫院醫學研究中心完成。
1.3材料
1.3.1實驗動物SD大鼠20只，3周齡，雌雄不限，體質量40-50g，由新疆醫科大學第一附屬醫院動物中心提供。1.3.2實驗試劑和儀器α-MEM(Hyclone，美國);PDGF-BB(R&D，美國);VEGF(PERROTECH，美國);CCK-8(DOJINDO，日本);倒置相差顯微鏡以及照相系統(萊卡，德國);酶聯免疫儀(THERMOFISHERSCIENTIFIC，美國);RT-PCR儀(BIO-RAD，美國);QuantiFast®SYBR®GreenPCRKit(QIAGEN公司，德國);胎牛血清(四季青，中國)。
1.4實驗方法
1.4.1骨髓間充質干細胞的培養SD大鼠脫頸后處死，取股骨及脛骨，剪去骨骺端，反復沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，離心后棄上清，加入α-MEM培養液均勻分裝至T25細胞培養瓶，放入細胞培養箱，3d后換液，7d傳代。取狀態良好的第3代細胞消化制成細胞懸液并計數備用。
1.4.2實驗分組及干預取第3代骨髓間充質干細胞，以2×105密度接種于6孔板，每孔2.5mL;以2×103密度接種于96孔板，每孔0.1mL。用含體積分數為10%胎牛血清的α-MEM培養液培養24h使細胞貼壁，吸棄原培養基，換成含不同質量濃度細胞因子及體積分數為10%胎牛血清的α-MEM培養液，此后每隔3d半量換液，每隔7d全量換液，每次換液均重新補充相應體積的生長因子，其中實驗1組加入100μg/LVEGF;實驗2組加入100μg/LPDGF-BB;實驗3組加入20μg/LVEGF+20μg/LPDGF-BB;實驗4組加入40μg/LVEGF+40μg/LPDGF-BB;實驗5組加入60μg/LVEGF+60μg/LPDGF-BB;實驗6組：加入80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB;實驗7組加入100μg/LVEGF+100μg/LPDGF-BB;實驗8組加入120μg/LVEGF+120μg/LPDGF-BB;對照組加入同等體積PBS。
1.5主要觀察指標
1.5.1CCK-8法檢測細胞增殖率細胞因子干預24h后，取1個96孔板進行CCK-8實驗，棄去原培養基，PBS洗滌1次，加入用a-MEM培養基稀釋的10%CCK-8溶液，每孔100μL，37℃孵育4h，450nm波長檢測吸光度值，確定細胞生長因子促骨髓間充質干細胞增殖的最佳質量濃度。每組4個樣本，實驗重復3次。接下來每天于固定時間取1個96孔板，在同一臺酶聯免疫儀上測吸光度值，確定細胞生長因子促骨髓間充質干細胞增殖的最佳作用時間。
1.5.2細胞形態觀察倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞數量、形態及排列有無變化。
1.5.3RT-PCR檢測成血管基因表達細胞因子干預第7，14天，采用RT-PCR檢測成血管基因血管生成素1、缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子的表達水平。參照PubmedGeneBank中的基因序列，設計相關基因引物，所有引物由上海生工公司合成。用TRIzol法提取RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度及純度。取待測樣品總RNA100ng，按照說明書進行反轉錄反應合成cDNA。將生成的cDNA稀釋成100mg/L，取2μL稀釋后的cDNA進行RT-PCR反應。配制成20μLPCR反應體系：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10μL，ForwardPrimer1μL，ReversePrimer1μL，cDNA模板2μL，RNase-FreeddH2O6μL。PCR反應條件為95℃、2min循環1次;95℃、5s循40次;60℃、10s循環40次，最后進入熔解曲線。成血管基因引物序列，見表1。
1.6統計學分析應用SPSS22.0軟件進行處理，數據以x_±s表示，確定最佳作用時間的4組細胞增殖率均數間比較采用2×2析因設計的方差分析，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有顯著性意義;將成血管基因在第7天和第14天的表達量進行重復測量檢驗，若其滿足球對稱性時，采用重復測量的單變量方差分析法，否則采用球對稱系數ε對自由度進行校正。
2結果Results
2.1確定細胞生長因子促細胞增殖的最佳質量濃度通過CCK-8試劑盒檢測不同質量濃度生長因子對骨髓間充質干細胞增殖能力的影響。實驗結果顯示聯合應用2種生長因子對骨髓間充質干細胞增殖的促進作用最強，且呈現劑量效應關系，最佳組合為80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB，繼續增加質量濃度后細胞增殖率變化不大，見圖1。因此，采用100μg/LVEGF組、100μg/LPDGF-BB組、80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB、對照組進行后續實驗。
2.2確定細胞生長因子促細胞增殖的最佳作用時間從圖2可以看出，對照組細胞增殖率隨著時間的延長僅有輕微增長，第6天已經進入細胞增殖停滯期，第7天時細胞增殖率顯著下降;其他3個實驗組隨著時間的延長，細胞呈指數增長，表現為較好的增殖活性，均在第6天時達到最佳的促增殖效果，提示細胞生長因子促進骨髓間充質干細胞增殖存在時間依賴效應，第7天時各實驗組細胞增殖率均明顯降低，原因可能與細胞衰老退化性能降低以及細胞生長因子存在半衰期有關。
在連續7d的觀測時間內，除了第7天，其他時間點3個實驗組的細胞增殖率均遠超對照組。VEGF+PDGF-BB組促細胞增殖效率最好，PDGF-BB組次之，VEGF組最差。第5，6天時，VEGF+PDGF-BB組促細胞增殖效率明顯高于PDGF-BB組和VEGF組，PDGF-BB組與VEGF組無顯著差異。第7天時，VEGF組、PDGF-BB組、對照組細胞增殖率接近，而VEGF+PDGF-BB組細胞增殖率依然較高，結合前期閱讀的大量文獻，選取7d作為最佳時間點，用于后續實驗。
2.3骨髓間充質干細胞的形態變化在倒置相差顯微鏡下觀察，最佳濃度生長因子干預7d后，實驗組細胞形態向內皮細胞分化：數量增多、體積變大、形態變長、伸出圓凸狀長觸角[9]，開始時呈現聚集趨勢，然后逐漸呈點狀、條帶狀、橫向變寬并有縱向連接趨勢排列似漁網狀，以上均提示加入因子后細胞成管能力增強，見圖3。
2.4RT-PCR檢測成血管基因表達在相應的時間點，分別檢測血管生成素1、缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子這4個成血管相關基因表達量，各實驗組與對照組相比成血管基因的表達均有所增加，差異有顯著性意義(P<0.05)，在以上4個成血管相關基因的mRNA表達上，VEGF主效應、PDGF-BB主效應、VEGF和PDGF-BB的交互效應差異均有顯著性意義(P<0.05)。VEGF、PDGF-BB都可以促進血管生成素1、缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子的mRNA表達，聯合應用時促表達效果最佳。
通過重復測量方差分析對時間因分析發現：缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子mRNA表達隨時間延長有所升高，差異有顯著性意義(P<0.05);而血管生成素1、胰島素樣生長因子mRNA表達量隨時間延長有所降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，結果見表2-4。
3討論Discussion.
種子細胞是骨組織工程研究中最基本的環節，骨髓間充質干細胞應用十分普遍，也是促血管化的優選細胞，具有較強的自我增殖及分化能力，體外實驗證實第3代骨髓間充質干細胞增殖、分化、遷移性能最好[10]。實驗選用第3代骨髓間充質干細胞進行相關實驗，避開了內皮祖細胞易于老化、培養成本低、形成血管不穩定等缺點[11]。
運用基因工程技術及基因轉染技術對種子細胞進行特定改造，為達到精確表達促血管生長因子提供新路徑，然而其技術敏感性高、安全性及有效性缺乏長期觀察[12]。因此，實驗采取直接滴入的方法加入VEGF和PDGF-BB這2種促血管生長因子，細胞與細胞、細胞與基質、細胞與細胞因子相互作用后，微觀上引起特定基因表達發生變化，合成特異性蛋白;宏觀上，在原血管結構的基礎上長出新血管[13]。此方法簡單、實用，經證實安全且有效。
鑒于在聯合使用生長因子時，其濃度和比例不同，可以產生截然相反的效果。細胞增殖能力很大程度上決定了種子細胞發揮效能的程度。實驗通過CCK-8法檢測不同質量濃度生長因子對細胞增殖的影響，試圖篩選出2種生長因子促進骨髓間充質干細胞增殖的最佳質量濃度組合使其發揮最大效能，并用于后續實驗。大量查閱文獻后，得出單一應用VEGF或PDGF-BB最佳質量濃度是100μg/L[14-15]，該實驗依次選取20-120μg/L質量濃度，結果顯示：VEGF和PDGF-BB均能促進細胞增殖，聯合應用效果最佳，存在濃度效應關系，最佳組合為：80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB。
血管形成是多種生長因子共同調控的結果，血管內皮細胞形成相關的信號通路包括：VEGF信號通路、PDGF-BB信號通路、TGF-β信號通路等[16]。VEGF、PDGF-BB的表達受諸多因素調節，近20年對于VEGF信號通路研究較多，該實驗直接加入這2種效果最為顯著且是研究熱點的細胞生長因子，研究對其他成血管特異性指標的影響。缺氧誘導因子1α是調節低氧狀態下多種平衡的中心環節，幾乎介導多細胞動物所有有核細胞對缺氧或缺血的適應性反應，能夠調節包括VEGF在內的下游基因，促進早期血管形成[17]。肝細胞生長因子的表達是血管形成前中期的重要標志性蛋白，通過減少纖維形成促進血管形成[18]。胰島素樣生長因子1主要存在于骨基質和長骨的生長面中，是骨形成過程中的調控因子，除了能促進成骨細胞增殖分化，亦能通過上調VEGF的表達從而促進血管內皮細胞的增殖、遷徙、管型形成，也是血管形成中后期的標志性蛋白[19]。血管生成素1在介導內皮細胞與細胞外基質的相互作用中起關鍵作用，并在血管形成的后期階段和血管重塑階段參與血管生成，促進血管重塑、成熟，有明確的成血管作用，為血管形成末期特異指標[20]。以上都是成血管的特異性指標，血管形成時mRNA的表達量均會上調，分別代表不同時期血管形成的程度。因此，在加入外源性VEGF和PDGF-BB后，通過檢測細胞外環境中缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子和血管生成素1的mRNA表達，能夠反映骨髓間充質干細胞的血管化程度。缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子和血管生成素1mRNA表達上調，反過來又勢必會影響骨髓間充質干細胞表達VEGF和PDGF-BB，內源性加上外源性VEGF和PDGF-BB同時增加，形成一個良性循環。
從加入VEGF及PDGF-BB到其對骨髓間充質干細胞成血管調節功能發揮作用需要一定的時間，基因表達發生變化一般7-14d就能體現，因此選擇7，14d這2個時間點對成血管特異性指標進行檢測，缺氧誘導因子1α、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子和血管生成素1表達均上調，說明VEGF和PDGF-BB對血管形成的整個階段都起到持續的促進作用。與第7天相比，第14天時所有成血管指標并不都上調，而是有增有減，又有潛在規律可循：早中期成血管指標缺氧誘導因子1α和肝細胞生長因子表達進一步增加，而中后期特異性成血管指標胰島素樣生長因子和血管生成素1表達稍降低，這也提示14d時血管形成仍處于早中期，尚未形成成熟血管網，與以往研究結論相符，以上現象都能通過復雜的成血管信號通路得到解釋[21]。
綜上所述，實驗證明聯合應用VEGF和PDGF-BB能促進骨髓間充質干細胞增殖，證實二者是相互促進的，加入PDGF-BB能促進VEGF調控形成的幼稚血管逐漸改建形成成熟功能血管網。當VEGF和PDGF-BB質量濃度均為80μg/L時，能夠持續穩定促進整個血管形成過程，且促進作用優于單一應用一種生長因子，為精確使用生長因子的質量濃度和時間提供了一定參考依據。然而，成血管是一個極其復雜的過程，不同階段需要的因子不同，是多種生長因子序貫參與、聯合作用的結果。為了真正模擬體內真實環境，是否還需要在特定階段加入其他某種或某些因子共同作用以及新的最佳質量濃度組合仍有待后續實驗進一步探究，實驗只檢測7，14d2個觀察時間點，后續還應該增加代表血管形成早期和后期的時間點，以便觀察到更加完整的血管形成動態變化過程和基因表達的波動變化。除了時間，空間對于血管形成的調控作用也尤為重要，有待后續動物實驗繼續探討。此外，VEGF和PDGF-BB上調缺氧誘導因子1α、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子和血管生成素1基因表達的機制仍有待深入研究。