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摘 要： 摘要目的：研究腎含鈣結(jié)晶鹽形成與維生素D受體(VDR)基因啟動子FokI位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)之間的關(guān)系。方法：根據(jù)超聲檢查進行分組：8O例腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽形成患者(A組)及8O例無結(jié)晶鹽形成者(B組)。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性(PCR.RFLP)對兩組
摘要目的：研究腎含鈣結(jié)晶鹽形成與維生素D受體(VDR)基因啟動子FokI位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)之間的關(guān)系。方法：根據(jù)超聲檢查進行分組：8O例腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽形成患者(A組)及8O例無結(jié)晶鹽形成者(B組)。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性(PCR.RFLP)對兩組進行FokI多態(tài)性檢測。分析兩組間基因型和等位基因的分布情況。結(jié)果：A組基因型分布FF：30%(24/80)。Ff：50%(40/80)，f：20%(16/80);B組FF：34%(27/80)，F(xiàn)f：60%(48/80)，f：6%(5/80);其中ff分布在兩組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A、B兩組F等位基因頻率分布分別為55%(88/160)和64%(102/160);f分別為45%(72/160)和36%(58/160)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論：VDR基因起始密碼子中FokI多態(tài)性與腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽形成有關(guān)系，超聲作為一種無創(chuàng)簡便的早期診斷方法在本研究中有著較重要的作用。
關(guān)鍵詞維生素D;受體;超聲檢查;多態(tài)性;結(jié)晶鹽;腎
含鈣結(jié)晶鹽的形成可能是導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)結(jié)石發(fā)生的重要條件之一，維生素D受體(vitaminDreceptor，VDR)在鈣的代謝中起著重要的作用[。VDR基因啟動子上存在有FokI位點單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。該SNP對尿鈣濃度有一定的影響E2]。超聲是一種無創(chuàng)、簡便經(jīng)濟的早期診斷腎結(jié)晶鹽的方法，我們通過超聲檢測腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽的形成，并分析結(jié)晶鹽與VDR基因啟動子SNP的關(guān)系，為研究泌尿系結(jié)石發(fā)生的原因提供一定的參考。
1對象與方法
1.1研究對象收集2009年8月至2011年3月在本科檢查的腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽患者80例作為觀察組(A組)，其中男52例，女28例，雙側(cè)10例，單側(cè)70例，年齡23～57歲，平均(37.09±9.07)歲。同時收集8O例無腎實質(zhì)結(jié)晶鹽形成者作為對照組(B組)，其中男58例，女22例，年齡21～56歲，平均(38.78-4-8.89)歲。兩組均無泌尿系統(tǒng)感染。排除泌尿系腫瘤及尿路梗阻，兩組年齡性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。參試者均簽署知情同意書。
1.2方法與儀器
1.2.1腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽的檢查兩組人群均行常規(guī)泌尿系統(tǒng)超聲檢查。超聲診斷儀機型為SIEMENS.Antares、ALOKA5000.探頭頻率3—6MHz.受檢者取仰臥位及側(cè)臥位。經(jīng)側(cè)腰部行冠狀切面觀察腎皮質(zhì)結(jié)晶鹽.有需要時經(jīng)背部行腎縱切面掃查，也可囑患者深吸氣.沿12肋骨下緣掃查顯示受肋骨遮擋部腎臟。結(jié)晶鹽超聲診斷為腎皮質(zhì)內(nèi)強回聲無聲影及后方伴不同程度彗星尾征，并排除部分弓形動脈鈣化、腎鈣乳囊腫、腎實質(zhì)小囊腫、腎鈣質(zhì)沉著等容易混淆的異常聲像圖，由兩位高年資超聲科醫(yī)師做出判斷。
1.2.2DNA的提取抽取實驗對象肘靜脈血2mL，經(jīng)EDTA抗凝.采用TIANampGenomicDNAKit試劑盒(深圳晶美)提取基因組。
1.2.3PCR擴增通過GenBank檢索到VDR基因序列『gi：29745161]，Genefisher設(shè)計引物：上游5ACTGACTCTGGCTCTGAC3：下游5CACCTTGCTFCTFCTCCC3，引物合成由深圳晶美公司完成。擴增VDR包含起始密碼FokI的DNA片段，預(yù)期產(chǎn)物片段246bp。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為50L，含2L模板DNA，8L上、下游引物，2LdNTPs，0.7LTaqDNA聚合酶和相應(yīng)的緩沖液。反應(yīng)條件為：預(yù)變性96~C8min.94℃45S.52℃146360s，72℃30s，共4O個循環(huán)。72℃延伸10min。
1.2.4PCR。RFLP分析多態(tài)性對起始密碼多態(tài)位進行PCR擴增后，取10PCR產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶FokI(深圳晶美)0.5L及10×buffer1L，牛血清白蛋白1L，DNA7.5L，總反應(yīng)體系20，37℃酶切，2%的瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物電泳，自動凝膠成像儀成像，檢測基因型。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。組間VDR基因型分布(計數(shù)資料)概率比較采用)(檢驗。
2結(jié)果
2.1腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽超聲影像圖見圖1。
2.2基因型的PCR.RFLP分析見圖2。
2.3VDR基因FokI多態(tài)性以及等位基因在兩組中的分布ff基因型在兩組問的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FF和FT基因在兩組間分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。F以及f基因頻率兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
3討論
泌尿系結(jié)石形成機制目前尚不明確.絕大多數(shù)結(jié)石成分中都含有鈣。所以高鈣尿是含鈣結(jié)石形成的重要原因之一[。孫建濤等[]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，高草酸尿可導(dǎo)致腎小管內(nèi)草酸鹽結(jié)晶沉積，合并梗阻后，會造出沉積加重。盧少明等_6]發(fā)現(xiàn)雄性激素會導(dǎo)致雄鼠內(nèi)腎結(jié)晶鹽的形成，當結(jié)晶鹽沉積于腎臟，聲像圖即可表現(xiàn)異常，主要在腎皮質(zhì)集合管沉積，隨著病程進一步發(fā)展，腎髓質(zhì)或乳頭處出現(xiàn)尿酸鹽結(jié)晶。多數(shù)結(jié)晶鹽特點是x線不顯影[.超聲可以顯示不透光的結(jié)晶鹽及結(jié)石.原發(fā)性腎結(jié)石形成過程中。在不存在梗阻的條件下，含鈣結(jié)晶鹽的形成可能在腎實質(zhì)。超聲檢查作為一種無創(chuàng)，方便，經(jīng)濟的檢查方式，相比x線檢查具有無射線，敏感性高等優(yōu)勢。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的VDR基因上存在的基因多態(tài)性位點有BsmI、TaqI、FokI等位點，其中FokI位于啟動子上E8-9]，啟動子結(jié)構(gòu)的改變對基因的表達會產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用，進而影響VDR的生物學(xué)功能。目前較多文獻研究飲食因素與腎實質(zhì)內(nèi)含鈣結(jié)晶鹽形成的相關(guān)性，王軍等[-o]研究發(fā)現(xiàn)，蘇子油可以使腎草酸鈣結(jié)晶形成明顯減少。已有研究分析VDR基因多態(tài)性與尿鈣濃度有一定的相關(guān)性…]。但VDR的基因改變是否影響腎實質(zhì)中含鈣結(jié)晶鹽的形成，有無相關(guān)性，目前尚無相關(guān)研究。
本研究運用超聲檢測早期腎皮質(zhì)結(jié)晶鹽的形成.并通過PCR—RFLP方法檢測VDR基因啟動子上存在的FokI基因SNP。分析其與。腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽形成的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)觀察組中ff基因型例數(shù)明顯高于對照組，說明ff基因型與腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽的形成有一定的相關(guān)性，攜帶ff基因型人群較其他兩類基因人群可能更容易發(fā)生腎皮質(zhì)含實用醫(yī)學(xué)雜志2012年第28卷第9期鈣結(jié)晶鹽的形成。
本實驗結(jié)果表明VDR基因啟動子上存在的FokISNP與人體的腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽形成之間存在一定關(guān)系，ff基因型可以作為導(dǎo)致結(jié)晶鹽形成的基因標記物之一，腎皮質(zhì)含鈣結(jié)晶鹽是否最終發(fā)展為結(jié)石，尚有待進一步研究。超聲作為一種無創(chuàng)方便的檢查手段可以作為腎結(jié)石早期診斷和追蹤的方法并為結(jié)石二級預(yù)防提供重要的參考信息。
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