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摘 要： 〔摘 要〕目的 依據(jù)GB/T19973.1-2015附錄中的指南對(duì)醫(yī)用脫脂棉生物負(fù)載的測(cè)定方法進(jìn)行研究。方法 以袋蠕動(dòng)法，采用0.9%氯化鈉注射液將樣品上的微生物最大化、最有效地重復(fù)洗脫下來，過程中均質(zhì)器的洗脫參數(shù)設(shè)定為拍擊頻率6次/s，運(yùn)行時(shí)間60s，然后采用薄膜過
〔摘 要〕目的 依據(jù)GB/T19973.1-2015附錄中的指南對(duì)醫(yī)用脫脂棉生物負(fù)載的測(cè)定方法進(jìn)行研究。方法 以袋蠕動(dòng)法，采用0.9%氯化鈉注射液將樣品上的微生物最大化、最有效地重復(fù)洗脫下來，過程中均質(zhì)器的洗脫參數(shù)設(shè)定為拍擊頻率6次/s，運(yùn)行時(shí)間60s，然后采用薄膜過濾法對(duì)洗脫液進(jìn)行過濾后，將濾膜移至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率和修正系數(shù)。結(jié)果 在以上試驗(yàn)條件下，醫(yī)用脫脂棉袋蠕動(dòng)法重復(fù)洗脫2次后的回收率均大于80%，修正系數(shù)為1.20。結(jié)論 該試驗(yàn)方法明確了袋蠕動(dòng)法重復(fù)洗脫的修正系數(shù)，適用于醫(yī)用脫脂棉生物負(fù)載的測(cè)定。
〔關(guān)鍵詞〕生物負(fù)載;醫(yī)用脫脂棉;回收率;修正系數(shù)
生物負(fù)載指一件產(chǎn)品和(或)包裝上或其中存活的微生物總數(shù)[1]。多年來，在醫(yī)療器械質(zhì)量控制方面，針對(duì)滅菌前后、產(chǎn)品的微生物檢驗(yàn)，通常將重點(diǎn)放在無菌檢驗(yàn)上，而忽視了對(duì)產(chǎn)品生物負(fù)載的檢測(cè)[2]。產(chǎn)品在滅菌前自然形成的生物負(fù)載(初始污染菌)的高低反映了生產(chǎn)環(huán)境的控制能力[3];若生物負(fù)載測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確，則不僅會(huì)影響滅菌參數(shù)的設(shè)定，還會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，直接關(guān)系到產(chǎn)品最終的整體安全性能，同時(shí)可將其作為醫(yī)用材料安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，甚至?xí)婕盎颊叩娜梭w安全;若生物負(fù)載水平增高，則會(huì)導(dǎo)致滅菌難度加大、滅菌不徹底、微生物的尸體過多，以及使用者出現(xiàn)炎癥、發(fā)熱等病理反應(yīng)。由于醫(yī)療器械產(chǎn)品的種類繁多，因此，根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適的生物負(fù)載檢測(cè)方法非常重要。
醫(yī)用脫脂棉作為被廣泛應(yīng)用的衛(wèi)生材料，屬于軟質(zhì)纖維材料，有很強(qiáng)的吸附性，且微生物對(duì)其表面的附著度較高;對(duì)于非無菌供應(yīng)的醫(yī)用脫脂棉，生物負(fù)載可以作為醫(yī)療單位滅菌時(shí)確定滅菌參數(shù)的重要依據(jù)。
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在醫(yī)療器械的微生物檢驗(yàn)中，將法定的標(biāo)準(zhǔn)及方法作為參照十分重要[4]。YY/T0330-2015《醫(yī)用脫脂棉》[5]4.14中指出，我們應(yīng)按GB/T19973.1-2015《醫(yī)療器械的滅菌微生物學(xué)方法第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測(cè)定》[1]規(guī)定的方法進(jìn)行生物負(fù)載試驗(yàn)，但GB/T19973.1-2015中并未針對(duì)該產(chǎn)品給出具體的操作方法，附錄中只有生物負(fù)載測(cè)定方法的設(shè)計(jì)要求及對(duì)所設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行確認(rèn)的指南，基于此，本研究依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)附錄對(duì)醫(yī)用脫脂棉的生物負(fù)載進(jìn)行了方法學(xué)研究。
1 儀器與設(shè)備
高壓蒸汽滅菌器(三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司，MLS-3750型);生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，BSC-1500ⅡB2-X型);微生物限度過濾系統(tǒng)(法國(guó)/默克，ZW-600型);無菌均質(zhì)器(寧波新芝生物科技有限公司，SCIENTZ-04型);生化培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司，ZXSD-B1160型);低溫生化培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司，ZXSP-A0160型);電子天平(德國(guó)賽多利斯，TE212-L型)。
2 材料與試劑
醫(yī)用脫脂棉[邢臺(tái)太行醫(yī)用材料有限公司(批號(hào)：190106)，石家莊市宏運(yùn)衛(wèi)生材料廠(批號(hào)：20181108)，河北康濟(jì)藥械有限公司(批號(hào)：181218)];胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：180427);沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：180912);0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，規(guī)格：500ml，批號(hào)：1802113204)。
3 修正系數(shù)的測(cè)定
依據(jù)GB/T19973.1-2015附錄B.2.2.1袋蠕動(dòng)法，在無菌環(huán)境下，取邢臺(tái)太行醫(yī)用材料有限公司樣品5個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確量取3份樣品，每份(1.0±0.1)g，放入無菌均質(zhì)袋中分別作為樣1、樣2、樣3，3份樣品分別加入100ml0.9%氯化鈉注射液至設(shè)定均質(zhì)器的洗脫參數(shù)，推薦將洗脫參數(shù)設(shè)定為拍擊頻率6次/s，運(yùn)行時(shí)間60s，啟動(dòng)均質(zhì)器，使洗脫液貫穿試樣內(nèi)外，均質(zhì)1min，然后取洗脫液進(jìn)行薄膜過濾，將每份試樣的洗脫液分別通過薄膜過濾等量、完全過濾到2張濾膜上，之后用100ml0.9%氯化鈉注射液對(duì)每張濾膜進(jìn)行沖洗(每份試樣按上述方法共洗脫10次，其余兩家的樣品按照同法操作);將濾膜菌面朝上分別放置在胰酪大豆胨瓊脂平板和沙氏葡萄糖瓊脂平板上，將洗脫后的試樣放置在空的平板中，倒入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行瓊脂覆蓋，使胰酪大豆胨瓊脂平板在30~35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d、沙氏葡萄糖瓊脂平板在20~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，取出，觀察計(jì)數(shù)。
依據(jù)表1~3的總CFU計(jì)算回收率，即洗脫1次的回收率為第1次洗脫的CFU與總CFU的百分比，洗脫2次的回收率為第1次洗脫的CFU與第2次洗脫的CFU之和與總CFU的百分比，見表4。
4 生物負(fù)載的計(jì)算
在無菌環(huán)境下，取待測(cè)樣品5個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確量取3份樣品，每份(1.0±0.1)g，分別作為樣1、樣2、樣3;按修正系數(shù)測(cè)定所采用的方法，將待測(cè)樣品的3個(gè)試樣分別洗脫2次，先計(jì)算每個(gè)試樣洗脫2次的菌落總數(shù)(M1、M2、M3)，然后計(jì)算M1+M2+M3的平均值M。
5 討論
影響產(chǎn)品生物負(fù)載水平的因素有很多，總體而言，在進(jìn)行生物負(fù)載測(cè)定時(shí)，我們應(yīng)考慮到產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)過程及特性等，為不同的步驟(取樣→微生物采集→移至培養(yǎng)基、培養(yǎng)計(jì)數(shù)→確定修正系數(shù)→確定生物負(fù)載量)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>
本研究通過采用袋蠕動(dòng)法將產(chǎn)品和一定體積的洗脫液裝在一個(gè)無菌均質(zhì)袋內(nèi)，開啟均質(zhì)器，設(shè)定拍擊頻率為6次/s，運(yùn)行時(shí)間為60s，使洗脫液貫穿樣品的內(nèi)外，最大化、最有效地將產(chǎn)品上的微生物重復(fù)洗脫下來，然后采用薄膜過濾法對(duì)洗脫液進(jìn)行過濾后，將濾膜放至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并計(jì)數(shù)，之后通過修正系數(shù)對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行修訂。本研究方法的關(guān)鍵在于如何最大化、最有效地將微生物洗脫下來，從而確定產(chǎn)品的生物負(fù)載，所以，我們需要根據(jù)產(chǎn)品的特性，選擇合適的洗脫液、洗脫速率、洗脫時(shí)間。不同的洗脫液、不同的洗脫速率、不同的洗脫時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致微生物不被檢測(cè)到或被破壞而導(dǎo)致其死亡，這些因素會(huì)造成微生物總檢出率低、微生物種類丟失等，進(jìn)而造成生物負(fù)載檢測(cè)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量控制[6]，因此，合理選擇生物負(fù)載指標(biāo)是確保產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)符合產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)管理要求的重要保證[7]。
由表1~3可知，樣品洗脫2次后，CFU增加緩慢;由表4可知，樣品洗脫2次后的回收率明顯增高，且回收率均大于80%。產(chǎn)品的回收率越高，生物負(fù)載檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度越高，但是，在實(shí)際檢測(cè)過程中，不能一味地追求高回收率，還應(yīng)綜合考慮檢測(cè)過程的便捷、高效，因此，本研究結(jié)合醫(yī)用脫脂棉特性及實(shí)際檢測(cè)過程，最終選擇洗脫2次的平均回收率來確定修正系數(shù)，最后確定生物負(fù)載量。在方法未改變的前提下，我們可以利用已得到的修正系數(shù)計(jì)算結(jié)果，使檢測(cè)方法得到簡(jiǎn)化[8];若回收率低于50%，則應(yīng)考慮其他改進(jìn)方法。——論文作者：康莉，李揮，刁立琴，付釗，高保栓，王志永，郭亞秋，馮毅(通信作者)