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摘 要： 摘要:本文分別采用乳酸菌與酵母菌發(fā)酵提取仙人掌多糖，并探究仙人掌多糖的抗炎功效。在三個單因素液料比、時間、pH方面探究仙人掌多糖的提取工藝，得到三因素最適組合，乳酸菌發(fā)酵最適提取工藝為發(fā)酵時間7h、液料比25∶1(mL/g)、pH為5，此工藝下多糖得率為0.
摘要:本文分別采用乳酸菌與酵母菌發(fā)酵提取仙人掌多糖，并探究仙人掌多糖的抗炎功效。在三個單因素液料比、時間、pH方面探究仙人掌多糖的提取工藝，得到三因素最適組合，乳酸菌發(fā)酵最適提取工藝為發(fā)酵時間7h、液料比25∶1(mL/g)、pH為5，此工藝下多糖得率為0.26%。黃酒酵母發(fā)酵最適提取工藝為發(fā)酵時間48h、液料比25∶1(mL/g)、pH為3，此工藝下多糖得率為0.53%。應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測仙人掌多糖對IL-6、IL-8炎癥細胞因子相關(guān)基因表達的影響，得知仙人掌多糖通過抑制IL-8的表達，促進IL-6的表達來抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展。
關(guān)鍵詞:仙人掌多糖，微生物提取技術(shù)，乳酸菌，酵母菌，抗炎
仙人掌(OpuntiadilleniiHaw)屬仙人掌科仙人掌屬植物，是熱帶及亞熱帶植物，多生長于美洲及墨西哥干旱荒漠或者是半荒漠地區(qū)，其中以墨西哥分布最多。我國主要分布在廣西、江西、廣東、福建、海南等地。仙人掌用途廣泛，如食用、做觀賞植物、藥用等。趙學敏所著的《本草綱目拾遺》中記載，仙人掌可作為藥用植物，其具有清熱解毒、安神利尿、行氣活血、消腫止痛、健脾止瀉的功效，可內(nèi)服，亦可外用治療疾病。
仙人掌內(nèi)豐富的仙人掌多糖(Opuntiadilleniipolysaccharide，ODP)是其有諸多功效的主要原因之一。ODP主要從仙人掌的果實和莖里提取而來，極性大分子化合物葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖是其主要組成物質(zhì)。目前，ODP的抗氧化、抗炎抑菌、免疫、降血糖血脂、抗腫瘤、護肝[1-10]等多種功效都已被證實。除上述的藥理功能，ODP還可防脫發(fā)[11]，治療神經(jīng)退行性疾病藥物[12]，促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能[13]。如今，仙人掌應(yīng)用愈加廣泛，如:市面上已有仙人掌制的果蔬汁、保健品和面粉制品出售。
傳統(tǒng)的提取多糖的方法如包含水提、堿提、酸提、苯酚提取、微波輔助提取、超聲輔助提取和酶提等方法[14]，存在多糖提取率低，純度不高，原料浪費嚴重，且影響對多糖進行結(jié)構(gòu)分析和功效鑒定等問題[15]。本實驗采用微生物法提取多糖，是利用微生物在生長過程中，會利用其他營養(yǎng)物質(zhì)進行生長，但并不利用多糖對植物多糖進行去雜純化，反應(yīng)條件溫和且能耗少。此外，因新鮮仙人掌肥厚的肉質(zhì)莖含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、纖維素和維生素C等，同時含有豐富的SOD、黃酮類及多糖等活性功能成分[16]，所以本實驗采用新鮮的仙人掌葉片來進行試驗。本文研究將從以下兩個方面進行:一是用乳酸菌、酵母菌發(fā)酵新鮮仙人掌來探究ODP提取工藝;二是用發(fā)酵得到的多糖液做抗炎實驗，探究ODP的抗炎活性。
1材料與方法
1.1材料與儀器
新鮮仙人掌生長期為3～8個月，云南白藥集團公司;硫酸、苯酚、葡萄糖(均為國產(chǎn)分析純)北京化工廠;乳酸菌北京川秀科技有限公司;酵母菌中國科學院微生物所;Hacat細胞中國檢驗檢疫科學研究院中德化妝品研究所細胞毒理實驗室;水、過濾超純水實驗室制備。
BS2202S型電子天平、A2492型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HR2195攪拌機勻漿機飛利浦有限公司;YZB-蘇(錫)1132-2004低速大容量離心機無錫市瑞江分析儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司;DSHZ-300恒溫水浴振蕩器江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠;電熱恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠;WJ-80A-ⅡCO2培養(yǎng)箱上海圣科;細胞培養(yǎng)瓶、板，凍存管美國Corning/Costar;ABI7300型熒光定量PCR儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;SW-CJ-1D超凈工作臺上海啟前電子科技有限公司;Enduro水平電泳儀美國Labnet公司;Sigma1-14微型離心機德國Sigma;Sigma3-30K高速臺式冷凍離心機德國Sigma;GeneAmpPCRSystem9700PCR儀美國ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
1.2實驗方法
1.2.1ODP提取工藝新鮮仙人掌莖洗凈、去刺、去皮后切碎，用勻漿機勻漿2min，再進行高壓滅菌(120℃，30min)，在超凈臺將加入4mL菌液加入100mL仙人掌勻漿液中后用封口膜封口，于空氣搖床(180r/min)培養(yǎng)，而后離心(20000r/min，10min)取上清，用旋蒸儀將上清液濃縮至原體積的1/3，再以3倍體積95%乙醇醇沉12h，再一次離心(20000r/min，10min)，取沉淀熱水(60℃)溶解得粗多糖液。
1.2.2ODP含量測定標準曲線繪制:參照苯酚硫酸法[17]，結(jié)果顯示在0～120μg/mL濃度范圍內(nèi)，葡萄糖與A490呈良好的線性關(guān)系，以吸光度對多糖濃度C進行線性回歸，得到回歸方程:y=0.0151x+0.0042(R2=0.9996)，y表示吸光度值A(chǔ)490，x表示仙人掌多糖的濃度，μg/mL。
ODP樣品含量測定:取兩只帶塞試管，分別吸取1mL待測液和1mL去離子水，再分別依次添加0.5mL5%苯酚，搖勻后加入2.5mL濃硫酸，蓋上試管蓋，再充分搖勻，靜置5min后，置于水浴鍋中沸水浴1h，測定吸光值A(chǔ)490。并根據(jù)回歸方程計算ODP濃度。
ODP得率(%)=所得的ODP濃度×仙人掌多糖液體積/仙人掌的質(zhì)量×100
1.2.3乳酸菌發(fā)酵法的單因素實驗
1.2.3.1時間對多糖得率的影響將提取的液料比固定為20∶1(mL/g)，溫度固定為35℃，pH固定為7，選取5個時間梯度5、6、7、8、9h，作為探究乳酸菌發(fā)酵提取時間的單因素條件，取一定量的多糖溶液，測定該因素下提取得到的多糖含量，從而計算得到多糖得率。
1.2.3.2液料比對多糖得率的影響將提取時間固定為7h，pH固定為7，溫度固定為35℃，選取5個液料比梯度10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)，作為探究乳酸菌發(fā)酵提取液料比的單因素條件，取一定量的多糖溶液，測定該因素下提取得到的多糖含量，從而計算得到多糖得率。
1.2.3.3pH對多糖得率的影響將提取的液料比固定為20∶1(mL/g)，溫度固定為35℃，時間固定為7h，選取5個pH梯度為3、4、5、6、7，作為探究乳酸菌發(fā)酵提取pH的單因素條件，取一定量的多糖溶液，測定該因素下提取得到的多糖含量，從而計算得到多糖得率。
按以上實驗所得的最佳單因素條件進行實驗，計算最大的仙人掌多糖得率。
1.2.4酵母菌發(fā)酵法的單因素實驗
1.2.4.1時間對多糖得率的影響將提取的液料比固定為20∶1(mL/g)，發(fā)酵溫度固定為28℃，pH固定為5.5，選取5個時間梯度24、36、48、60、72h作為探究黃酒酵母發(fā)酵提取時間的單因素條件，取一定量的多糖溶液，測定該因素下提取得到的多糖含量，從而計算得到多糖得率。
1.2.4.2液料比對多糖得率的影響將提取時間固定為48h，pH固定為5.5，溫度固定為28℃，選取5個液料比梯度10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)，作為探究黃酒酵母發(fā)酵提取液料比的單因素條件，取一定量的多糖溶液，測定該因素下提取得到的多糖含量，從而計算得到多糖得率。
1.2.4.3pH對多糖得率的影響將提取的液料比固定為25∶1(mL/g)，溫度固定為28℃，時間固定為48h，選取5個pH梯度3、4、5、6、7作為探究黃酒酵母發(fā)酵提取pH的單因素條件，取一定量的多糖溶液，測定該因素下提取得到的多糖含量，從而計算得到多糖得率。
1.2.5細胞培養(yǎng)凍存人表皮永生化細胞(Hacat細胞)從-80℃的冰箱中取出后，迅速37℃水浴，輕微震動1～2min使其徹底融化。1000r/min離心10min，棄上清。加1mL細胞培養(yǎng)液(Dulbecco’sModifiedEagle’smedium，DMEM)，轉(zhuǎn)移到10cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。細胞生長到90%融合時，動作輕柔地用2mL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗兩次。加200μL0.25%胰酶后，放入CO2培養(yǎng)箱中消化5min，在觀察確認細胞已從培養(yǎng)瓶壁上脫落后，加2mL的完全培養(yǎng)液終止消化，800r/min離心l0min，去上清液，加入4mL培養(yǎng)液，計數(shù)后，以5×105密度接種于10cm2培養(yǎng)瓶。
1.2.6MTT法測定Hacat細胞毒性實驗選取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的Hacat細胞。用0.25%胰蛋白酶將Hacat細胞消化，1500r/min離心1min后重懸于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，計數(shù);用96孔培養(yǎng)板接種細胞，并設(shè)置空白對照，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充，在5%CO2，37℃環(huán)境中培養(yǎng)12h;按照各自終濃度分別加入ODP，細胞對照組是未做處理的組，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)44h后，加入5g/L的MTT溶液，繼續(xù)在37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng);吸除孔內(nèi)液體，用PBS洗滌1次，加入DMSO溶解結(jié)晶;M3讀板儀測定各孔吸光度值A(chǔ)570。分別用0.5、1、2、2.5、5mg/mLODP處理Hacat細胞。
Hacat細胞存活率(%)=(測定孔吸光度值-空白對照組吸光度值)/(細胞對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100
1.2.7ODP處理時間對炎癥細胞因子IL-6、IL-8基因表達的影響將消化后的細胞(消化方法參照1.2.5)，以2×106/孔的密度接種6孔板內(nèi)，以0.5mg/mL的ODP處理細胞不同時間(0、0.5、1、1.5、2h)。提取細胞總RNA，熒光定量分析處理對炎癥細胞因子在轉(zhuǎn)錄水平表達的影響，內(nèi)參基因定為β-actin。
1.2.8炎癥細胞因子IL-6、IL-8基因在轉(zhuǎn)錄水平表達量的測定
1.2.8.1細胞總RNA提取與檢測總RNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，參照文獻[18-19]。
1.2.8.2cDNA第一鏈合成使用TINAGENFastQuantRTKit(WithgDNase)FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)進行cDNA第一條鏈合成反應(yīng)。將得到的cDNA中加1000μLddH2O，稀釋混勻，-20℃保存。
1.2.8.3引物及探針的設(shè)計和合成根據(jù)NCBI發(fā)布的IL-6、IL-8等基因的序列，用PrimerExpress軟件設(shè)計特異性引物，同時設(shè)計管家基因β-actin的特異性引物。基因引物序列見表1。
1.2.8.4實時熒光定量PCR以cDNA為模板，反應(yīng)體系為20μL，其中PrimeScriptRTEnzymeMIX10.4μL，ddH2O7.6μL，正向、反向引物各0.5μL，cDNA模板1μL，使用ABI7300熒光定量PCR儀擴增實驗樣本，擴增條件為95℃2min預(yù)變性，然后按95℃15s，57℃20s，72℃30s，做42個循環(huán)，在72℃收集熒光信號。
1.3數(shù)據(jù)處理
實驗中每個處理重復(fù)三次，用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析，應(yīng)用Origin9.0軟件作圖。
2結(jié)果與分析
2.1乳酸菌發(fā)酵提取多糖單因素實驗
2.1.1時間對得率的影響按照方法
2.1.2液料比對得率的影響按照方法1.2.3.2探究不同液料比對ODP提取的影響，結(jié)果見圖2，隨著液料比的增加，ODP得率顯著性增加(p<0.05)，當液料比為20∶1mL/g增加為25∶1mL/g時，得率不顯著增加達到最大值0.23%(p>0.05)，隨后得率顯著性下降(p<0.05)。這是因為在一定范圍內(nèi)，增加提取液體積可以增加溶劑與提取物質(zhì)的接觸面積，使多糖得以較多溶出，但繼續(xù)增加提取液體積會使多糖達到飽和[20]。因此，乳酸菌發(fā)酵提取的最佳提取液料比為25∶1mL/g。
2.1.3pH對得率的影響按照方法
1.2.3.3探究不同pH對ODP提取的影響，結(jié)果見圖3，隨著pH升高，ODP得率顯著增加(p<0.05)，在pH=5時得率達到了最大值0.28%，pH在5～6時得率不顯著降低(p>0.05)，超過6之后，得率顯著降低(p<0.05)。這是因為乳酸菌適宜在弱酸情況下生長，隨著pH的降低，菌體生長受到抑制[21]。因此，選取5作為乳酸菌發(fā)酵提取的最佳pH。以溫度為35℃，時間為7h，pH為5，液料比為25∶1mL/g為試驗條件，提取ODP，所得的ODP得率為0.26%。經(jīng)過工藝優(yōu)化的熱水浸提法得到的得率最高為0.12%[22]，乳酸菌發(fā)酵的ODP得率比熱水浸提法的得率高出0.14%。
2.2酵母提取多糖的單因素實驗
2.2.1時間對得率的影響按照方法
2.2.2液料比對得率的影響按照方法
1.2.4.2探究不同液料比對ODP提取的影響，結(jié)果見圖5，隨著液料比的增加，ODP得率發(fā)生顯著性變化，當液料比達到20∶1mL/g，ODP出現(xiàn)降低，當液料比達到25∶1mL/g，得率升高到最大為0.48%，隨后得率顯著下降(p<0.05)。這是因為在一定范圍內(nèi)，隨著液料比的增大，提取液體積變大，提取的損耗增加，在液料比20∶1mL/g時損耗增大量大于提取率的增大量，當提取液體積繼續(xù)增大時，損耗比提取得率的增加量小，但當達到某一提取液體積時，多糖溶出會達到飽和從而使ODP得率下降。因此，取25∶1mL/g為黃酒酵母發(fā)酵提取最佳液料比。
2.2.3pH對得率的影響
按照方法1.2.4.3探究不同pH對ODP提取的影響，結(jié)果見圖6，在pH=3時ODP得率最高0.53%，隨著pH的增加得率顯著降低(p<0.05)。黃酒酵母適應(yīng)偏酸性環(huán)境，但不適應(yīng)強酸。因此，黃酒酵母發(fā)酵提取最佳pH為3。
經(jīng)過工藝優(yōu)化的熱水浸提法得到的得率最高為0.12%[22]，經(jīng)本實驗所得的黃酒酵母發(fā)酵的工藝條件為溫度28℃，時間48h，液料比25∶1mL/g，pH為3，得率能達到0.53%，比熱水浸提法得率到了4倍。
2.3MTT法測定Hacat細胞毒性如圖7所示，以未加任何ODP的細胞作空白對照，當ODP濃度高達2mg/mL時，細胞增殖活力依然超過90%，說明ODP對細胞幾乎無毒性。且當ODP濃度減小，細胞增殖活力反而增加，ODP濃度為0.5mg/mL時，細胞存活率高達109.07%，說明低濃度ODP對HacaT有增殖作用。
2.4ODP處理時間對炎癥細胞因子IL-6、IL-8基因表達的影響
考察時間效應(yīng)，用ODP處理Hacat細胞，2h內(nèi)炎癥因子類基因(IL-6、IL-8)表達量產(chǎn)生了不同的變化。
促炎癥因子IL-6是一種在炎癥和免疫反應(yīng)中具有多種功能細胞因子，可以促進炎癥反應(yīng)中花生四烯酸的釋放，刺激T細胞活化和增殖，提高B細胞中免疫球蛋白的生成，并且誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生[23]。ODP添加時間對促炎癥因子IL-6表達量的影響如圖8所示，可看出15min內(nèi)基因表達量出現(xiàn)降低，15～30min時間內(nèi)IL-6表達量平緩升高，而在30～90min時間內(nèi)，表達量發(fā)生了顯著的提高(p<0.01)，此后又緩慢下降，在2h的表達量與60min時的表達量差不多，但是顯著高于初始值(p>0.05)。整體來看，30min后的促進作用是ODP對IL-6基因表達量的主要影響。ODP對IL-6基因表達量的影響作用，可驗證ODP可能是通過促進IL-6基因的表達從而影響花生四烯酸的代謝而起到抗炎作用的。
IL-8在許多炎癥反應(yīng)中具有聚集和激活淋巴細胞、白細胞和血管內(nèi)皮細胞的功能，可因局部產(chǎn)生的IL-8直接作用于表皮細胞，促進慢性炎癥的發(fā)展[24]。ODP添加時間對的其表達量的影響如圖9所示，IL-8基因的表達量在15min內(nèi)迅速下降，顯著低于初始值(p<0.01)，并在之后的15min內(nèi)繼續(xù)緩慢下降，在30～90min這段時間內(nèi)在保持顯著小于初始值的范圍內(nèi)緩慢上升(p<0.05)，而之后到2h之間，其又緩慢下降。整體來看，在0～15min內(nèi)ODP迅速抑制IL-8的表達，并在2h的時間內(nèi)ODP始終保持抑制IL-8的表達，這是ODP對IL-8基因作用的主要體現(xiàn)。大量的中性粒細胞因IL-8表達的增高而向炎癥區(qū)域聚集，從而釋放炎癥介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)。IL-8的表達因受到ODP作用而受到抑制，間接地炎癥的發(fā)生和發(fā)展就受到抑制。
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3結(jié)論
在本課題的研究中，采用乳酸菌與黃酒酵母對用微生物法提取多糖進行了初步探索。結(jié)果顯示，同樣直接使用新鮮的仙人掌汁進行提取，采用乳酸菌發(fā)酵最適提取工藝:發(fā)酵時間7h、液料比25∶1(mL/g)、pH為5，此工藝下多糖得率為0.26%。黃酒酵母發(fā)酵最適提取工藝:發(fā)酵時間48h、液料比25∶1(mL/g)、pH為3，此工藝下多糖得率為0.53%，黃酒酵母發(fā)酵所得ODP得率遠遠高于乳酸菌，因此選取黃酒酵母作為發(fā)酵菌種提取ODP會更有優(yōu)勢。本課題也探究了ODP抗炎能力，結(jié)果顯示ODP通過抑制IL-8的表達，促進IL-6的表達來抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展，為研究仙人掌的抗炎效果提供理論依據(jù)。