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摘 要： 摘要: 減數(shù)分裂重組不僅保證了真核生物有性生殖過程中染色體數(shù)量的穩(wěn)定，還通過父母親本間遺傳物質(zhì)的互換在后代中產(chǎn)生遺傳變異。因此，減數(shù)分裂重組是遺傳多樣性形成的重要途徑，也是生物多樣性和物種進化的主要動力。在絕大多數(shù)真核生物中，不管染色體數(shù)目
摘要: 減數(shù)分裂重組不僅保證了真核生物有性生殖過程中染色體數(shù)量的穩(wěn)定，還通過父母親本間遺傳物質(zhì)的互換在后代中產(chǎn)生遺傳變異。因此，減數(shù)分裂重組是遺傳多樣性形成的重要途徑，也是生物多樣性和物種進化的主要動力。在絕大多數(shù)真核生物中，不管染色體數(shù)目的多少或基因組的大小，減數(shù)分裂重組的形成都受到嚴格的調(diào)控，但抑制減數(shù)分裂重組的分子機理目前仍不清楚。近年來，通過正向遺傳學篩選鑒定出多個減數(shù)分裂重組抑制基因，揭示了抑制基因的功能和調(diào)控途徑。本文基于擬南芥中減數(shù)分裂重組抑制基因的研究現(xiàn)狀，綜述了植物減數(shù)分裂重組抑制基因研究取得的突破性進展，并結(jié)合基因功能與其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)闡述了抑制植物減數(shù)分裂重組的分子機理。
關(guān)鍵詞: 減數(shù)分裂;同源重組;抑制基因;調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
減數(shù)分裂(meiosis)是生物細胞中染色體數(shù)目減半的一種特殊的細胞分裂方式，在該過程中 DNA 只復制一次，但細胞連續(xù)分裂兩次，從而形成染色體數(shù)目減半的配子[1~3]。在減數(shù)第一次分裂過程中，為了確保同源染色體的精確分離和染色體數(shù)目的減半，同源染色體間需要形成至少一個物理連接點，稱為交叉結(jié)(chiasmata)[4,5]。交叉通過修復作用產(chǎn)生同源染色體間遺傳物質(zhì)的相互交換，即同源染色體間的重組(recombination)，進而形成具有遺傳多樣性的配子[6,7]。減數(shù)分裂同源重組不僅保證了物種染色體的精確分離，同時又促進了父母親本之間遺傳物質(zhì)的相互交換，從而在配子中形成遺傳變異[8,9]。因此，減數(shù)分裂同源重組對生物進化和物種形成至關(guān)重要，也是植物新品種培育和開發(fā)的基礎(chǔ)生物學過程。特別是在全球氣候變化的背景下，人類面臨各種挑戰(zhàn)，減數(shù)分裂同源重組為充分利用植物的遺傳多樣性進行新品種的培育和創(chuàng)新提供了基礎(chǔ)。
從植物進化的角度，重組率是生物在重組成本和重組優(yōu)勢之間維持的一種特定平衡，是物種長期以來對環(huán)境變化不斷進化和演變的一種適應(yīng)和自然選擇[10]。在大多數(shù)真核生物中，由于調(diào)控重組基因的高度保守性，減數(shù)分裂重組率被維持在一個相對較低的水平，并且遠低于其自身的自然潛力，但對其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抑制形成的分子機理還知之甚少[11,12]。減數(shù)分裂同源重組是真核生物有性生殖過程中的基本生物學過程，其相關(guān)研究一直是遺傳學領(lǐng)域的核心科學問題，受到世界學者的廣泛關(guān)注[13~16]。近年來，植物減數(shù)分裂同源重組的分子調(diào)控研究取得了重大進展，特別是多個減數(shù)分裂重組抑制基因陸續(xù)在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，進一步增加了對這一復雜生物學過程的認識。本文以擬南芥為對象，綜述了植物減數(shù)分裂重組抑制基因研究的重要進展。
1 DNA 雙鏈斷裂和交叉形成
1.1 DNA 雙鏈斷裂的產(chǎn)生
減數(shù)分裂同源重組起始于 DNA 雙鏈斷裂(double strand break, DSB)，其由高度保守的拓撲異構(gòu)酶SPO11 (sporulation 11)蛋白催化形成(圖 1)[6,17]。SPO11 蛋白結(jié)構(gòu)類似于古細菌中的 TopoⅥ (Topoisomerase Ⅵ) A 亞基，而 TopoⅥ是由兩個 A 亞基和兩個 B 亞基組成的異源四聚體酶(A2B2 heterotetramer)[5]。最近，古細菌 TopoⅥ復合體 B 亞基的同源蛋白 MTOPVIB (meiotic topoisomerase VIB-like)在擬南芥和水稻 (Oryza sativa)中被鑒定，研究顯示其在減數(shù)分裂中對誘導 DSB 形成和重組啟動至關(guān)重要[18,19]。
擬南芥基因組存在 3 個 SPO11 同源基因 (SPO11-1、SPO11-2 和 SPO11-3)，但只有 SPO11-1 和 SPO11-2 作為異源二聚體參與調(diào)控減數(shù)分裂重組的啟動，而 SPO11-3 只涉及體細胞的有絲分裂，不具有調(diào)控減數(shù)分裂的功能[20,21]。在植物中，其他一些基因也參與了誘導減數(shù)分裂 DSB的形成，如 PRD1 (putative recombination initiation defect 1)、PRD2、 AtPRD3/OsPAIR1 (homologous pairing aberration in rice meiosis 1)、DFO (DSB formation)和 CRC1 (central region component 1) [22~26]。不同于大部分植物中含有多個 SPO11 同源基因，在動物和酵母中只含有 1 個 SPO11 基因[27,28]。酵母中的 DSB 形成除了需要 SPO11 蛋白以外，還有其他 9 個蛋白參與調(diào)控，即 RED50 (radiation sensitive 50)、MER2 (meiotic recombination 2)、MEI4 (meiosis defective4)、MRE11 (meiotic recombination 11)、REC102 (recombination-deficient 102)、REC104 (recombination-deficient 104)、REC114 (recombination-deficient 114)、SKI8 (superkiller 8) 和 XRS2 (X-ray sensitive 2)[2,29]。然而，這些參與酵母 DSB 形成的蛋白在物種間存在蛋白序列或者功能上的變異。如擬南芥中 DSB 的形成并不需要 MRE11、 RAD50 和 XRS2 蛋白的參與，但這些蛋白直接作用于斷裂雙鏈 5′末端的切除;SKI8 盡管在幾種真菌中非常保守，但在擬南芥中并不保守，且不參與減數(shù)分裂重組過程[30,31]。
1.2 重組中間體的形成與分解
DNA 雙鏈斷裂產(chǎn)生之后，MRN 復合體(MRE11、 RAD50 和 NBS1)對斷裂雙鏈任一側(cè)的 5′末端進行切割，并產(chǎn)生3′端單鏈DNA(ssDNA)尾巴的突出端[32,33]。隨后在 DMC1 (DNA meiotic recombinase 1)和 RAD51 (radiation sensitive 51)重組酶的促進作用下，這些 ssDNAs 啟動同源序列搜索并入侵同源染色體或者非同源染色體的姐妹染色單體形成穩(wěn)定的單鏈侵入中間體[34,35]。DMC1 是首次在酵母中發(fā)現(xiàn)的減數(shù)分裂特異基因，只在減數(shù)分裂過程中發(fā)揮作用，而 RAD51 參與了有絲分裂和減數(shù)分裂的重組。Kurzbauer 等[36]通過細胞學研究發(fā)現(xiàn) DMC1 和 RAD51 重組酶傾向于定位于減數(shù)分裂 DSB 的相反兩端，表明其在DSB 修復過程中承擔著不同的生物學功能，這也與 DSB 兩端不同的修復結(jié)果兼容。在單鏈入侵形成中間體后，3′末端入侵鏈作為引物縱向延伸到同源雙鏈 DNA (dsDNA)中形成 D-loop (displacement loop)結(jié)構(gòu)[37]。D-loop 的形成是減數(shù)分裂同源重組的重要中間體，其形成表明 3′端入侵單鏈成功定位到了同源 DNA 參考序列[38]，該早期中間體在之后可以通過不同的修復途徑形成同源染色體交叉或者非交叉 (non-crossovers, NCOs)[39,40]。
D-loop 在酶催化作用下進一步被修復形成 Holliday junction (HJ)中間體結(jié)構(gòu)，HJ 是由兩個同源雙鏈 DNA 分子互換配對并相互連接形成的一種“十字交叉”中間體(four-way junction)[41]。HJ 中間體的形成被認為是同源染色體交叉產(chǎn)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其兩種類型的中間體(sHJ 和 dHJ)通過不同的修復途徑產(chǎn)生兩種類型的交叉[42,43]。在單鏈入侵形成 D-loop 結(jié)構(gòu)后，如果 D-loop 的入侵鏈沒有繼續(xù)縱向延伸，則形成一個“十字交叉”中間體 sHJ (single Holliday junction)，進一步被 Mus81 (methyl methane sulfonate and ultraviolet sensitive 81)蛋白分解產(chǎn)生Ⅱ型交叉 (class Ⅱ CO)或者非交叉[39]。如果 D-loop 入侵鏈繼續(xù)深入延伸到同源斷裂雙鏈中，并捕獲斷裂雙鏈的第二端進行退火、合成與連接，則形成獨特的異源雙鏈 DNA 結(jié)構(gòu) dHJ (double Holliday junction)，并通過 ZMM (ZIP-MSH-MER)途徑分解形成Ⅰ型交叉(class Ⅰ CO)[40]。
1.3 交叉的形成被嚴格限制
在減數(shù)分裂開始初期，DNA 雙鏈產(chǎn)生大量雙鏈斷裂，但不管基因組的大小或者染色體數(shù)目的多少，只有極少數(shù)的斷裂雙鏈被修復形成交叉，其余的大量 DSBs 通過不同的途徑和機制修復形成了非交叉。在模式植物擬南芥中，細胞學分析認為每個減數(shù)分裂的細胞大約形成 200 個雙鏈斷裂，但只有約 10 個斷裂雙鏈被修復形成交叉，其余的斷裂雙鏈則被修復產(chǎn)生非交叉，但到目前為止抑制交叉形成的機理尚不清楚[44~48]。
目前，多項研究表明交叉的形成主要受多個機制的共同影響，如交叉保障(obligate CO)、交叉干涉 (CO interference)、交叉穩(wěn)態(tài)(CO homeostasis)和抗交叉因子(anti-CO factor)[49~59]。交叉保障是指每個配對同源染色體之間需要至少形成一個交叉以保障同源染色體后期的準確分離[49]。但是，在大部分生物中，一個交叉的形成會抑制其兩側(cè)相鄰位置中另一個交叉的產(chǎn)生，最終導致交叉在染色體上非隨機分布，這種現(xiàn)象被稱為交叉干涉[50,51]。而交叉穩(wěn)態(tài)則作為系統(tǒng)性緩沖機制，在早期交叉前體 DSB 數(shù)量急劇變化的情況下保持交叉數(shù)量的穩(wěn)定[52,53]。近年來，減數(shù)分裂重組抑制基因在擬南芥中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，揭示了重組中間體如何通過合成型依賴性退火反應(yīng) (synthesis-dependent strand annealing, SDSA)途徑分解為非交叉的機制[54~59]。
1.4 交叉形成的遺傳途徑
在大多數(shù)真核生物的減數(shù)分裂重組中至少存在兩種不同的交叉形成途徑，根據(jù)對交叉干擾是否敏感將其分為Ⅰ型交叉和Ⅱ型交叉[60~62]。其中，Ⅰ型交叉為干涉敏感型交叉，約占交叉總數(shù)的 80%~ 85%，主要受保守的 ZMM 途徑的調(diào)控，包括 MSH4 (mutS homolog 4)[63]、MSH5 (mutS homolog 5)[64]、MER3 (meiotic recombination 3)[65,66]、ZIP4 (zinc transporter 4 precursor)[67]、SHOC1 (shortage of crossovers 1)[68]、 HEI10 (human enhancer of cell invasion No.10)[69]、 RFC1 (replication factor C1)[70]、PTD (parting dancers)[1,71] 和 POL2A (DNA polymerase 2A)[72]等蛋白。而與Ⅰ型交叉對應(yīng)的是干涉不敏感的Ⅱ型交叉，該交叉的形成依賴于兩條平行的途徑：MUS81 途徑和 FANCD2 途徑[73~75]。
通常情況下，兩種交叉形成途徑廣泛存在于在大多數(shù)真核生物中，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，哺乳動物和植物[9,76]。但也有例外，如在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中，其減數(shù)分裂期間只形成 sHJ 中間體，故只存在Ⅱ型交叉形成途徑[39]。而在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans) 中，所有的交叉均表現(xiàn)為干擾敏感，表明其交叉的產(chǎn)生均通過Ⅰ型交叉形成途徑[77]。此外，值得注意的是，在擬南芥 msh4 mus81 fancd2 三突變體中，雖然同時缺乏形成Ⅰ型和Ⅱ類型交叉的所有關(guān)鍵基因，但仍有交叉形成，這說明阻斷Ⅰ型和Ⅱ型交叉形成途徑后觸發(fā)了其他未知的交叉形成途徑產(chǎn)生交叉[74,75]。這種現(xiàn)象也被證實存在于果蠅和酵母中，這些證據(jù)表明其他交叉形成途徑的存在，且與已知的交叉形成途徑同時共存或是互斥獨存[78,79]。
2 減數(shù)分裂重組抑制基因
在大多數(shù)真核生物的減數(shù)分裂過程中，雙鏈斷裂與交叉形成的比率(DSBs/COs)存在極大差異，如擬南芥中 DSBs/COs 比率約為 200∶10，這表明生物進化過程中存在著遺傳機制限制大多數(shù)斷裂雙鏈修復形成交叉[80]。近年來，許多調(diào)控減數(shù)分裂過程的基因已經(jīng)被克隆,但抑制減數(shù)分裂同源重組的分子機理仍不太清楚[20,25,81,82]。
多種模式植物(如擬南芥和水稻)基因組測序的完成和全基因組測序技術(shù)的成熟，加速了植物減數(shù)分裂重組抑制基因的鑒定與功能研究。2012 年，為了揭示減數(shù)分裂重組抑制基因，法國科學家 Crismani 等[54]利用正向遺傳學通過 EMS 誘變擬南芥 zmm 突變體種子和大規(guī)模突變體篩選，并獲得多個重組恢復系，最終鑒定出抑制Ⅱ型交叉形成的 9 個基因 (FANCM、MHF1/2、TOP3α、RECQ4A/B、FIGL1、 RMI1 和 FLIP，圖 2)[54~57]。該研究巧妙利用了 zmm 突變體短角果的表型(因缺乏Ⅰ型交叉形成的 ZMM 基因而育性降低)進行果夾表型恢復系的篩選，其原理是重組抑制基因的突變會降低或者喪失重組抑制作用，這能促進交叉的形成和重組率的提高，進而恢復 zmm 突變體的育性，使植株的果夾變長甚至恢復原有長度。這樣的重組恢復植株能非常容易的通過果夾長度表型篩選出來，最后通過全基因組測序鑒定突變基因。例如，擬南芥 FANCM 基因突變后，恢復了 zip4 突變體的育性，使 zip4 突變體的短果夾增長，進而篩選獲得 fancm 突變體。
2.1 FANCM 聯(lián)合 MHF1 與 MHF2 抑制減數(shù)分裂重組
FANCM (fanconi anemia complementation group M)解旋酶是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的首個減數(shù)分裂重組抑制蛋白，研究認為其通過 SDSA 途徑分解 D-loops 中間體產(chǎn)生非交叉，從而抑制Ⅱ型交叉的形成[54,83,84]。擬南芥 fancm 突變體的交叉數(shù)量在雌雄兩性的減數(shù)分裂過程中都得到極大提高，重組率也比野生型平均增加了 3 倍，但其植株的生長和生育情況與野生型無異，表明重組率的增加并不會影響植物的生長發(fā)育，證明植物在自然選擇和進化過程中形成了遺傳抑制機制限制過多的交叉形成[54]。由于Ⅰ型交叉特異性指示蛋白 MLH1 不能標記 fancm 突變體中增加的交叉，且花粉熒光標記四分體分析顯示 fancm 突變體中不存在交叉干涉，證明 FANCM 不是通過Ⅰ型交叉形成途徑抑制重組。而 fancm mus81 雙突變體表現(xiàn)出嚴重的生長缺陷且缺乏二價體，表明 fancm 突變體中增加的交叉形成依賴 MUS81 蛋白。因此， FANCM 是通過Ⅱ型交叉形成途徑抑制減數(shù)分裂重組。進一步研究發(fā)現(xiàn)，雙突變體 fancm-1 spo11-1 和 fancm-1 dmc1 中的交叉未能恢復，表明 fancm 突變體中增加的交叉需要 SPO11 和 DMC1 蛋白的參與，即 FANCM 的抑制作用發(fā)生在 DNA 雙鏈斷裂和單鏈入侵之后[54]。在酵母中，F(xiàn)ANCM 的同源基因 MPH1 和 FML1 分別在芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae) 和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中同樣被證實通過分解 D-loops 中間體促進 SDSA 途徑的非交叉形成[84,85]。
通過對所有 FA(fanconi anemia)途徑相關(guān)蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)只有 FANCM 的 DNA 結(jié)合輔助因子 MHF1 和 MHF2 具有抑制減數(shù)分裂重組的功能，其通過形成異源四聚體來增強 FANCM 解旋酶的活性，促進 FANCM 與 DNA 結(jié)合，從而抑制Ⅱ型交叉的形成[55,86~89]。在擬南芥多個突變體中，雙突變體 msh5 mhf1、msh5 mhf2、hei10 mhf2 和三突變體 hei10 mhf1 mhf2 中二價體的形成沒有差異，證明 MHF1 和 MHF2 通過相同的途徑抑制減數(shù)分裂重組[55]。另一方面，mhf2 突變體僅能提高 1.6 倍重組率，但 fancm 和 fancm mhf2 突變體卻能達 3 倍的增加，這表明 MHF2 與 FANCM 抑制重組的途徑是一致的，但 MHF2 的抑制作用弱于 FANCM[55]。此外，在 mhf1 mus81 和 mhf2 mus81 雙突變體中表現(xiàn)出嚴重的減數(shù)分裂缺陷，但單突變體 mhf1、mhf2 和 mus81 中未觀察到明顯的減數(shù)分裂缺陷，表明 MHF1 和 MHF2 對減數(shù)分裂重組的抑制作用依賴于 MUS81，這與 FANCM 的抑制途徑相同[55]。因此，MHF1 和 MHF2 作為輔助因子參與 FANCM 的Ⅱ型交叉形成途徑抑制減數(shù)分裂重組。
2.2 BTR 重組抑制途徑
在減數(shù)分裂過程中，為了避免染色體間的糾纏和斷裂，DNA 雙鏈斷裂及其修復過程中產(chǎn)生的重組中間體需要通過不同的途徑分解成為交叉或者非交叉[90]。高度保守的 BTR 復合體(bloom syndromeTopoisomerase 3α-RecQ-mediated genome instability 1)在擬南芥(BLM-TOP3α-RMI1)和酵母(SGS1-TOP3α- RMI1)中通過限制減數(shù)分裂重組中間體形成交叉，進而保障了染色體的完整[91~94]。例如，BTR 復合體中的 RECQ4A/B、TOP3α 和 RMI1 蛋白通過同一途徑抑制Ⅱ型交叉的形成，但與 FANCM 抑制途徑不同[58]。 RECQ4A 和 RECQ4B 屬于哺乳動物 BLM (酵母中為 SGS1)中的兩個冗余同源蛋白，且 RECQ4B 只存在于十字花科植物中[95,96]，而 TOP3α 和 RMI1 為 BTR 復合體中的單拷貝基因[96]，其相互作用在減數(shù)分裂重組中發(fā)揮多種功能。
首先，RECQ4A/B、TOP3α 和 RMI1 蛋白均能通過 D-loop 重組中間體分解途徑阻止Ⅱ型交叉的形成，促進非交叉的產(chǎn)生，但花粉熒光標記四分體對不同突變體重組率的檢查顯示不同基因及組合對重組提高的強度不同[58]。例如，單突變體 recq4a 和 recq4b 中的重組率沒有顯著增加，而雙突變體 recq4a recq4b 中的重組率平均提高了 5 倍，突變體 recq4a recq4b fancm 的重組率甚至提高了 9 倍。這樣的重組疊加效應(yīng)也發(fā)生在 top3α和 top3α fancm、rmi1和 rmi1 fancm 突變體中，其重組率分別平均提高了 3 倍和 5 倍、4 倍和 5 倍，這表明 BTR重組抑制途徑與 FANCM 途徑相互獨立但并非功能冗余，這可能與 BTR 復合體在減數(shù)分裂重組過程中發(fā)揮多種功能有關(guān)[56,58]。由于 RECQ4A/B、TOP3α 和 RMI1 兩兩組合的突變體中(recq4ab top3α、recq4ab rmi1 和 top3α rmi1) 均表現(xiàn)出嚴重的減數(shù)分裂缺陷，導致不能直接測量這些基因型組合的重組率，但推測其可能通過同一途徑協(xié)同抑制交叉形成，因為：(1) RECQ4A/B、 TOP3α 和 RMI1 同屬于 BTR 蛋白復合體，且均從擬南芥和其他物種的體細胞中共同純化形成;(2) recq4ab 和 rmi1 突變體具有相似的重組增加情況;(3) 其與 fancm 形成的雙突變體均表現(xiàn)重組疊加效應(yīng)。
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