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摘 要： 摘要：為研究渤海灣近岸污染對遠(yuǎn)近岸海域微生態(tài)的影響，利用高通量測序技術(shù)，對渤海灣不同離岸距離的6個站位采集表層海水，進(jìn)行浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合環(huán)境、空間因素探究影響其變化的主要因素。結(jié)果表明：研究區(qū)域存在環(huán)境因子的梯度變化，如氮營養(yǎng)鹽在
摘要：為研究渤海灣近岸污染對遠(yuǎn)近岸海域微生態(tài)的影響，利用高通量測序技術(shù)，對渤海灣不同離岸距離的6個站位采集表層海水，進(jìn)行浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合環(huán)境、空間因素探究影響其變化的主要因素。結(jié)果表明：研究區(qū)域存在環(huán)境因子的梯度變化，如氮營養(yǎng)鹽在近岸高于遠(yuǎn)岸;細(xì)菌α-多樣性在不同站位間差異不顯著，但仍顯示在近岸相對較高;細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨離岸距離變化顯著，γ-變形菌和擬桿菌在近岸顯著富集，且與氮營養(yǎng)鹽的含量有關(guān);藍(lán)細(xì)菌在遠(yuǎn)岸顯著富集，且與氨氮、透明度、電導(dǎo)率有關(guān);鄰體矩陣主坐標(biāo)單獨(dú)解釋部分對群落結(jié)構(gòu)變異的貢獻(xiàn)率最大(38.1%)，說明可能存在尚未測量但具有空間結(jié)構(gòu)的環(huán)境變量影響群落空間分布;結(jié)合功能預(yù)測的結(jié)果推測近岸區(qū)域的富營養(yǎng)與烴類污染等可能影響群落變化。本文從環(huán)境和空間影響兩方面探討了渤海灣不同離岸距離的海域浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，為研究渤海灣海洋生態(tài)及環(huán)境保護(hù)提供一定的參考。
關(guān)鍵詞：渤海灣;浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);地理分布;功能預(yù)測;鄰體矩陣主坐標(biāo)
1 引言
渤海灣位于渤海西部，是我國九大海灣之一，周圍集中了海洋化工、港口、灘涂養(yǎng)殖和鹽業(yè)等多種經(jīng)濟(jì)活動，是開發(fā)利用海洋資源比較活躍的地區(qū)之一[1]。隨著城市化進(jìn)程的加快和臨港工業(yè)的發(fā)展，陸源排海污染物不斷增加，傾廢、船舶以及海水養(yǎng)殖等對海域生態(tài)環(huán)境造成巨大壓力[1]。排海污水主要包括耗氧有機(jī)物、無機(jī)氮、無機(jī)磷和油類等，嚴(yán)重超標(biāo)的污染物加之渤海灣為半封閉港灣、與外海交換能力差的特征，導(dǎo)致渤海灣海洋環(huán)境質(zhì)量急劇惡化。微生物作為一類多樣性最高的生命形式，在地球化學(xué)循環(huán)(碳循環(huán)，氮循環(huán)，硫循環(huán)，磷循環(huán)和金屬循環(huán)等)中承擔(dān)著重要的生態(tài)功能，復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)、功能、相互作用及其動態(tài)變化對環(huán)境生態(tài)功能的維持有重要意義。海洋微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和特性在一定程度上反映了海洋生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境狀況[2]。深入研究渤海灣微生物群落結(jié)構(gòu)與分布特征對認(rèn)識和預(yù)測渤海灣海洋生態(tài)功能極為重要[3]。已有的關(guān)于渤海灣微生物多樣性的調(diào)查研究主要集中在對浮游細(xì)菌數(shù)量變化及與環(huán)境因子的關(guān)系等方面[4–5]，而對海洋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性變化及其受環(huán)境和空間因素的影響則少有報道。近年來，越來越多的海洋生態(tài)學(xué)家開始關(guān)注自然環(huán)境中空間距離和環(huán)境因子在微生物群落結(jié)構(gòu)形成和維持中的作用。在具體的研究中，空間距離代表歷史因素、擴(kuò)散限制等;環(huán)境因素代表當(dāng)代氣候、物理、化學(xué)的環(huán)境變化[6]，這兩者被認(rèn)為是驅(qū)動當(dāng)前微生物多樣性差異的主要因素[7–10]。目前，國內(nèi)相關(guān)的研究主要集中在東海、南海近岸海域，如Xiong等[11]報道了東海沉積物中的細(xì)菌群落存在地理分布特征且與氮污染梯度有關(guān)系，發(fā)現(xiàn)空間距離對細(xì)菌群落變化的影響要高于環(huán)境因子;同時，Wang等[12]對東海沿岸浙江省區(qū)跨越8個海岸帶的表層海水中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的研究表明，環(huán)境和地理因素共同影響部分對該區(qū)域浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化解釋度最高。Zhang等[13]對南海沿海海域400～500km范圍內(nèi)的總菌群和活性菌群多樣性的分析表明在研究區(qū)域內(nèi)細(xì)菌群落存在的地理分布特征是環(huán)境和距離衰減共同作用的結(jié)果，其中環(huán)境因子與群落組成的關(guān)系相較于地理距離與群落組成的關(guān)系更加緊密。這些研究均顯示在近岸海洋環(huán)境中，微生物群落的地理分布規(guī)律均分別受空間因素和環(huán)境因素的影響，但是針對半封閉港灣的相關(guān)研究尚未見報道。
針對渤海灣而言，其地理水文環(huán)境與上述海域相比有其獨(dú)特性，渤海灣是一種淺灘淤泥質(zhì)海灣，海底地形自岸向海傾斜，沿岸受人類活動影響較大，半封閉港灣的特征決定了其與外海交換能力差，沿岸各類污染加劇了渤海灣的生態(tài)負(fù)擔(dān)。已有的關(guān)于渤海灣微生物生態(tài)學(xué)研究更加關(guān)注浮游細(xì)菌豐度和沉積物中細(xì)菌群落的變化，如趙海萍等[14]基于浮游細(xì)菌的豐度變化對渤海灣浮游細(xì)菌分布特征進(jìn)行研究，為了解渤海灣浮游細(xì)菌的生態(tài)環(huán)境狀況提供了有力的數(shù)據(jù)支持;另外，劉鵬遠(yuǎn)等[15]對渤海灣表層沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究較為全面的探討了海洋環(huán)境因素與沉積物微生物群落構(gòu)成、分布與多樣性的聯(lián)系，其重點(diǎn)關(guān)注環(huán)境因子對表層沉積物群落的影響。目前，對空間因素同環(huán)境因素在渤海灣浮游細(xì)菌群落變化中的影響作用研究還較為匱乏。為進(jìn)一步研究渤海灣近岸環(huán)境污染對渤海灣近岸及遠(yuǎn)岸的海洋微生物生態(tài)產(chǎn)生的影響，本文試圖探究渤海灣灣區(qū)內(nèi)從近岸到遠(yuǎn)岸接近渤海中央淺海盆地的區(qū)域內(nèi)，隨離岸距離的變化，浮游細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和組成變化，通過對營養(yǎng)鹽等污染物含量和群落的變化進(jìn)行相關(guān)研究，來回答近岸污染對渤海灣沿岸由近及遠(yuǎn)的海洋環(huán)境微生態(tài)的影響程度，并通過方差分解分析地理空間因素和環(huán)境因素對該區(qū)域細(xì)菌群落變化的貢獻(xiàn)，進(jìn)一步基于群落結(jié)構(gòu)預(yù)測該區(qū)域微生物功能的空間變化特征，為深入了解微生物群落在渤海灣海洋環(huán)境中的生態(tài)功能提供參考。
2 材料和方法
2.1海水樣品的采集
2014年8月中旬，采集了渤海灣38.6714°～38.6591°N，117.7273°～118.8841°E范圍內(nèi)6個站位(圖1)的海水樣品，站位劃分為3個小區(qū)域：近岸站位(TJ16、TJ23、TJ27);中間站位(TJ13、TJ17);遠(yuǎn)岸站位(TJ14)。每個站點(diǎn)的地理坐標(biāo)見表1。對每個站位采集1.5L的表層海水(0.5m)樣品。隨船記錄環(huán)境參數(shù)(水溫、濕度、鹽度、電導(dǎo)率、溶解氧等環(huán)境參數(shù))。采集的水樣于采樣船上，每個樣品取500mL用經(jīng)滅菌處理的100μm孔徑的尼龍布預(yù)過濾后用0.2μm孔徑的聚碳酸酯膜(Millipore，USA)過濾，置于預(yù)先滅菌容器中存于冰盒，4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室儲存于−80℃冰箱以待后續(xù)檢測分析。剩余水樣用于海水水質(zhì)測定。每個站位采集3個重復(fù)。
2.2海水理化性質(zhì)測定
pH、鹽度、電導(dǎo)率和溶解氧(DO)利用探頭測定(Multi3420，WTW，Germany)，其余理化性質(zhì)的測定均參照標(biāo)準(zhǔn)方法(GB17378.4—2007)�；钚粤姿猁}含量使用鉬藍(lán)比色法測定，氨氮含量使用苯酚次氯酸鹽法測定，活性硅酸鹽含量使用硅鉬藍(lán)比色法測定，亞硝酸鹽含量使用對氨基苯磺酰胺法測定，硝酸鹽含量則使用Cd-Cu柱還原成亞硝酸鹽后按照亞硝酸鹽含量測定法測定�？扇苄钥偀o機(jī)氮含量則是通過將氨氮，硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量相加獲得。海水中的化學(xué)需氧量(COD)使用堿性高錳酸鉀法測定。
2.3細(xì)菌基因組提取與目的片段擴(kuò)增、測序
利用MoBio強(qiáng)力水樣DNA提取試劑盒(MOBIO，USA)對海水樣品進(jìn)行微生物總DNA提取。利用16SrRNA基因V4區(qū)引物：F515(5′–GTGCCAGCMGCCGCGGTAA–3′)和R806(5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′)[16]進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。擴(kuò)增子樣品測序前的準(zhǔn)備工作參照Illumina公司《16S宏基因組測序文庫制備-為IlluminaMiSeq系統(tǒng)制備16S核糖體RNA基因擴(kuò)增子》使用說明書進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)物利用IlluminaMiseq測序儀進(jìn)行高通量測序。測序樣品的原始數(shù)據(jù)已上傳至中國科學(xué)院北京基因組研究所大數(shù)據(jù)中心建立的組學(xué)原始數(shù)據(jù)歸檔庫中，獲取編號為CRA000481，訪問網(wǎng)址：http://bigd.big.ac.cn/gsa。
2.4測序結(jié)果分析
測序產(chǎn)生的雙端序列使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，參數(shù)默認(rèn)[17]。拼接后序列使用QIIME軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾[18]，過濾標(biāo)準(zhǔn)：(1)刪除長度小于200bp和大于450bp的序列;(2)篩選質(zhì)量大于20(即準(zhǔn)確度99%)的序列;(3)最少有連序75%的堿基質(zhì)量高于20。過濾后的序列，利用USEARCH檢測嵌合體，并使用filter_fasta.py命令將其去除[19]。然后基于條形碼信息對樣本序列進(jìn)行分配[18]。利用Uclust[19]對優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進(jìn)行聚類，并將其分配給可操作分類單元(OperationalTaxonomicUnit，OTU)。選取每個OTU中豐度最高的序列作為代表序列。代表序列基于Greengenes數(shù)據(jù)庫[20]進(jìn)行分類，使用PyNAST[21]基于Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對。清除被分類到葉綠體、線粒體、古生菌、真核生物或未知序列的序列以及單序列。為了保持?jǐn)?shù)據(jù)的一致性，對高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理，每個樣本隨機(jī)選擇3000條序列子集(對應(yīng)樣本的最小測序量)來計算樣本之間的多樣性、群落組成和群落距離。
2.5統(tǒng)計分析
根據(jù)取樣點(diǎn)的地理坐標(biāo)計算各個站位的離岸距離，對各站位營養(yǎng)鹽含量(主要是COD、無機(jī)氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、活性磷酸鹽、活性硅酸鹽)基于Gower距離進(jìn)行Cluster聚類分析;利用KruskalWallis秩和檢驗(yàn)對各站位間的細(xì)菌多樣性、優(yōu)勢物種組成差異進(jìn)行檢驗(yàn);基于Jaccard和Bray-Curtis算法，對各樣本OTU組成數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principlecoordinateanalysis，PCoA)。
基于取樣點(diǎn)坐標(biāo)，利用趨勢面分析(trendsurfaceanalysis，Trend)和鄰體矩陣主坐標(biāo)(principalcoordinatesofneighbourmatrices，PCNM)分析模擬各種可能的空間結(jié)構(gòu)。趨勢面分析是利用數(shù)學(xué)曲面模擬地理系統(tǒng)要素在空間上的分布及變化趨勢，該方法較為粗放，主要是對數(shù)據(jù)進(jìn)行除趨勢處理[22];PCNM分析是基于空間坐標(biāo)位置，模擬出一系列不同尺度上具有空間自相關(guān)的特征值，作為空間變量來解釋不同機(jī)制引起的群落結(jié)構(gòu)變化[6,23]。PCNM分析首先構(gòu)建樣點(diǎn)之間的歐式距離矩陣，削減距離矩陣規(guī)模，只保留一定規(guī)模的鄰體之間的距離。其次，計算削減距離矩陣的主坐標(biāo)分析，并保留具有正空間相關(guān)的特征向量[6]。最后使用保留的特征向量作為空間變量，運(yùn)用于多元數(shù)據(jù)分析當(dāng)中。PCNM分析可以獲得很多比取樣間隔更寬尺度的正交空間變量，可以對任何類型的空間結(jié)構(gòu)(規(guī)則取樣、不規(guī)則取樣)進(jìn)行建模[6]。顯著的PCNM變量可以被定義為寬尺度、中尺度和微尺度變量，一般是任意設(shè)定，需要指出的是，隨著PCNM軸的增加，其所代表的空間尺度逐漸減小[23]，但目前尚沒有統(tǒng)一的方法將PCNM變量定義為寬尺度、中尺度和微尺度變量。對于寬尺度和中尺度PCNM變量可以認(rèn)為是模擬的尚未測量但存在空間結(jié)構(gòu)的微生境變量;微尺度PCNM變量大部分情況是模擬由群落動態(tài)產(chǎn)生的局部空間結(jié)構(gòu)，可能與中性生物學(xué)過程有關(guān)，通常與環(huán)境變量沒有關(guān)系[6]。
變差分解分析(RariancePartitioningAnalysis，VPA)可以用于評估環(huán)境變量與所有尺度的空間變量對響應(yīng)變量的解釋程度[6]。變差分解的目的是量化各種不同因素單獨(dú)或共同解釋響應(yīng)變量變差的比例，其中，線性趨勢可以視為產(chǎn)生變差的一部分來源。線性趨勢可以發(fā)生在響應(yīng)變量，也可以發(fā)生在解釋變量，在進(jìn)行變差分解之前，需要檢驗(yàn)線性趨勢的顯著性，如果趨勢顯著，變差分解過程應(yīng)考慮線性趨勢的影響[6]。結(jié)合以上，以環(huán)境參數(shù)作為環(huán)境數(shù)據(jù)源，浮游細(xì)菌群落組成作為生物數(shù)據(jù)源，基于趨勢面分析和PCNM分析模擬的空間結(jié)構(gòu)作為空間因子數(shù)據(jù)源，構(gòu)成環(huán)境因子、空間因子與物種組成矩陣，利用VPA分析環(huán)境變量和空間變量對浮游細(xì)菌群落分布的單獨(dú)解釋量和共同解釋量。在進(jìn)行上述分析之前，對原始環(huán)境數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)變換，對物種數(shù)據(jù)通過海林格變換(Hellingertransform)進(jìn)行中心變換。在模型構(gòu)建過程中，分別對環(huán)境變量(Env)、Trend和PCNM變量進(jìn)行前向選擇，即根據(jù)R2準(zhǔn)則，如果在保留的變量基礎(chǔ)上獲得的校正R2已經(jīng)等于或者稍大于全模型的校正R2，則停止選擇[6]。
基于線性判別分析流程(lineardiscriminantanalysis(LDA)effectsizepipeline，LEfSe)[24]確定每組的顯著差異分類單元，該流程可在網(wǎng)址：http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/獲取。取LDAscore=2.0(α=0.05)的閾值作為判別標(biāo)準(zhǔn)，選擇one-against-all作為比對方式，對組間相對豐度差異顯著的分類單元進(jìn)行識別�；谄栠d相關(guān)系數(shù)衡量各變量與差異分類單元之間的關(guān)系。利用FAPROTAX工具對微生物群落功能進(jìn)行預(yù)測[25]，基于Bray-Curtis算法對群落功能進(jìn)行主坐標(biāo)分析，并基于主坐標(biāo)分析的聚類結(jié)果進(jìn)行各組別群落功能的差異分析(Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn))。
3 結(jié)果分析
3.1取樣站位地理環(huán)境與海水理化性質(zhì)分析
結(jié)合環(huán)境參數(shù)(表1)，可以看到取樣站位的水深是遠(yuǎn)岸站位最深，中間站位次之，近岸站位最淺。此外，物理環(huán)境參數(shù)，氣壓、電導(dǎo)率、鹽度的變化隨離岸距離變化不大，溫度(水溫和氣溫)在遠(yuǎn)岸站位較低、近岸站位較高，濕度和透明度在遠(yuǎn)岸站位較大，近岸站位較小;化學(xué)環(huán)境參數(shù)，總無機(jī)氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽含量在遠(yuǎn)岸站位較低，近岸站位較高，氨氮含量則在TJ14站位含量最高，其次是TJ27、TJ17，然后是TJ23、TJ13、TJ16，氨氮含量的變化并未隨離岸距離的增大而減小;活性硅酸鹽和活性磷酸鹽含量在近岸站位和遠(yuǎn)岸站位相差不大;DO含量在遠(yuǎn)岸站位相對高于近岸站位;COD含量則整體上近岸站位高于遠(yuǎn)岸站位，但是在遠(yuǎn)岸站位中，TJ14的COD含量明顯高于中間站位(TJ13、TJ17)�；谥饕獱I養(yǎng)鹽，如硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、無機(jī)氮、活性磷酸鹽、活性硅酸鹽、COD在各個站位海水樣品中的含量，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示6個站位聚成3組，TJ14站位單獨(dú)一組，TJ13與TJ17站位聚成一組，TJ16、TJ23與TJ27站位聚成一組(圖2)。主要營養(yǎng)鹽含量的聚類結(jié)果，與站位距離具有較高的一致性，該結(jié)果表明在本文的研究范圍內(nèi)，渤海灣的海水水質(zhì)隨離岸距離呈現(xiàn)出梯度變化的趨勢。
相關(guān)期刊推薦：《海洋學(xué)報》中文版(月刊)創(chuàng)刊于1979年，是由中國海洋學(xué)會主辦、中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會主管、海洋出版社出版的海洋科學(xué)技術(shù)綜合性學(xué)術(shù)期刊。主要刊登海洋物理、海洋化學(xué)、海洋地質(zhì)、海洋生物四大學(xué)科及海洋交叉學(xué)科和海洋工程環(huán)境等基礎(chǔ)研究和應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面具有創(chuàng)造性、代表我國海洋科學(xué)技術(shù)高水平的原創(chuàng)文章。有投稿需求的作者，可以咨詢期刊天空在線編輯。