發(fā)布時(shí)間：所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:在對秦皇島1例貉流產(chǎn)病例診斷時(shí)，從流產(chǎn)胎兒肝臟、脾臟、心臟等臟器分離出1株優(yōu)勢菌株，該菌在血瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈溶血。對分離菌進(jìn)行鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定、16SrDNA基因測序分析和血清型檢測試驗(yàn)，鑒定該菌;并進(jìn)一步對分離菌進(jìn)行致病
摘要:在對秦皇島1例貉流產(chǎn)病例診斷時(shí)，從流產(chǎn)胎兒肝臟、脾臟、心臟等臟器分離出1株優(yōu)勢菌株，該菌在血瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈β溶血。對分離菌進(jìn)行鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定、16SrDNA基因測序分析和血清型檢測試驗(yàn)，鑒定該菌;并進(jìn)一步對分離菌進(jìn)行致病性試驗(yàn)、藥物敏感性試驗(yàn)、毒力基因和耐藥基因檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示:分離菌為大腸桿菌，血清型為O89型，并命名為LCE-1。LCE-1感染小鼠可致小鼠死亡，低濃度感染懷孕母鼠可致流產(chǎn)，LCE-1的毒力基因Vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA檢測陽性。LCE-1對麥迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林等19種抗生素耐藥，LCE-1的四環(huán)素類(tetA、tetC、tetD)、β-內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)、氨基糖苷類(aadA1、strA-strB)、磺胺類(sul1、sul2)耐藥基因檢測陽性。綜上所述，本研究從貉流產(chǎn)胎兒分離出致病大腸桿菌LCE-1，該菌株具有較強(qiáng)的致病力和耐藥性，揭示大腸桿菌可能為貉流產(chǎn)的病原。
大腸桿菌(Escherichiacoli)是畜禽生產(chǎn)中的常見致病菌，不同類型的大腸桿菌所致發(fā)病癥狀存在差異。腸外致病性大腸桿菌可引起動(dòng)物急性敗血癥、呼吸道炎癥以及泌尿道炎癥等[1]。毛皮動(dòng)物也可感染大腸桿菌，主要表現(xiàn)為腹瀉、肺炎，嚴(yán)重可致敗血癥死亡。尤其是大腸桿菌性肺炎，近年來在毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖中十分常見，是造成毛皮動(dòng)物死亡的最主要病原之一[2]。大腸桿菌感染還可引起懷孕母畜流產(chǎn)[3]。前期報(bào)道從多種動(dòng)物流產(chǎn)胎兒分離出致病性大腸桿菌，揭示其可能是重要的致流產(chǎn)病原[4-7]。大腸桿菌感染引起毛皮動(dòng)物流產(chǎn)鮮見報(bào)道，2015、2018年的2例報(bào)道首次從流產(chǎn)藍(lán)狐(Vulpeslagopus)和水貂(Mustelavison)胎兒體內(nèi)分離大腸桿菌，懷疑其可能在毛皮動(dòng)物上引發(fā)流產(chǎn)的致病原[4-5]。
春季是毛皮動(dòng)物繁殖季節(jié)，也是流產(chǎn)的高發(fā)季節(jié)。在毛皮動(dòng)物上能夠引起流產(chǎn)的病原主要有阿留申病毒、偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒等病毒性病原以及加德納氏菌(Gardnerellavaginalis)、布氏桿菌(Brucella)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等細(xì)菌性病原。除此之外，附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)、旋毛蟲(Trichinellaspiralis)、蛔蟲(Ascarislumbricoides)等寄生蟲也可能引起流產(chǎn)[8-9]。多種病原均可導(dǎo)致毛皮動(dòng)物流產(chǎn)，使臨床診斷流產(chǎn)原因難度增加，因此，大腸桿菌往往被忽略。
2019年5月接診到一起貉(Nyctereutesprocyonoides)流產(chǎn)病例，對其致病原進(jìn)行檢測，結(jié)果未檢測到可致母貉出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀的病毒、寄生蟲等病原。對流產(chǎn)胎兒肝臟、脾臟、心臟等臟器細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，分離到1株能在血瓊脂平板上出現(xiàn)β溶血環(huán)的大腸桿菌，將分離菌株接種小鼠，證實(shí)其具有較強(qiáng)致病性，感染懷孕母鼠可致流產(chǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其致病和耐藥情況復(fù)雜。
1材料與方法
1.1材料
貉流產(chǎn)胎兒來自秦皇島市某發(fā)病貉養(yǎng)殖場送樣，無菌采取肝臟、脾臟、心臟等臟器。
1.2主要試劑與儀器
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京陸橋科技股份有限公司;哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(羊血)，購自廣州迪景微生物科技有限公司;革蘭氏染色液，購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;藥敏紙片，購自杭州天和微生物科技股份有限公司;ID32E腸道菌鑒定試條，購自法國梅里埃公司;D2000plusDNAmarker，購自中科瑞泰科技有限公司;E.coliO型診斷血清，購自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司;2×TaqMasterMix，細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR儀器、瓊脂糖凝膠電泳成像儀、立式自動(dòng)壓力蒸氣滅菌器、無菌工作臺(tái)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱等，由河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。PCR擴(kuò)增引物合成和序列測定服務(wù)均由上海生工生物公司完成。
1.3試驗(yàn)動(dòng)物維通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
1.4病原菌的分離鑒定
1.4.1病原菌的分離、鑒別培養(yǎng)與革蘭氏染色
用滅菌后棉簽無菌蘸取肝臟、心臟、脾臟等臟器樣品，接種于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12h，挑取單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯，37℃200r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h。將分離菌分別在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，37℃恒溫培養(yǎng)12h后觀察菌落狀態(tài)。對分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。
1.4.2生化特性鑒定
參考李文艷[10]的方法，用ID32E腸道菌鑒定試條對分離菌進(jìn)行生化鑒定，并用ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行判定。
1.4.3分離菌的16SrDNA鑒定
用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，并以其為模板，參考張志強(qiáng)等[11]的16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR，引物序列:16Sr-F(5'CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3');16Sr-R(5'-CAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3')。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，將測序結(jié)果拼接，用NCBIBLAST分析比對。
1.4.4大腸桿菌血清型檢測
采用單因子血清玻片凝集法測定大腸桿菌的血清型，具體操作參照試劑說明書。
1.5致病性試驗(yàn)
試驗(yàn)前參考文獻(xiàn)[10]處理母鼠使其懷孕。選取8周齡小鼠，公母各1只合籠。次日，觀察母鼠是否有陰門栓形成，若有，則判定為妊娠，繼續(xù)飼養(yǎng)6d后挑選5只懷孕母鼠進(jìn)行試驗(yàn)。
相關(guān)期刊推薦：《野生動(dòng)物學(xué)報(bào)》1979年創(chuàng)刊，是唯一一份關(guān)于科學(xué)研究與科普宣傳相結(jié)合、以科學(xué)研究為主的國家級(jí)雜志。主要內(nèi)容是以野生動(dòng)物生態(tài)學(xué)、行為學(xué)、分類學(xué)、管理學(xué)、分子生物學(xué)、保護(hù)生物學(xué)以及飼養(yǎng)繁殖、疾病防治、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開發(fā)利用等應(yīng)用基礎(chǔ)研究性論文為主。讀者對象為大專院校生命科學(xué)學(xué)院及科學(xué)研究單位的研究人員和野生動(dòng)物保護(hù)管理工作都及野生動(dòng)物愛好者。
參考李巧玲等[4]及張志強(qiáng)等[11]的攻毒劑量，進(jìn)行致病性試驗(yàn)。未懷孕組小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.2mL菌液(菌液濃度為1.0×108cfu/mL)，懷孕組母鼠5只，每只母鼠腹腔注射0.2mL菌液(菌液濃度為1.0×104cfu/mL)。對照組未懷孕小鼠和懷孕母鼠各5只，每只小鼠腹腔注射0.2mL無菌PBS。觀察并記錄每組小鼠狀態(tài)。
1.6毒力基因檢測
以提取分離菌DNA為模板，用PCR方法檢測分離菌毒力基因攜帶情況。大腸桿菌毒力基因參考文獻(xiàn)[12](表1)，PCR反應(yīng)程序退火溫度58℃。
1.7藥物敏感性試驗(yàn)
按照美國臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B藥敏紙片法對分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取抑菌圈直徑平均值為最終結(jié)果。
1.8耐藥基因檢測
參照1.4.3中的方法提取細(xì)菌基因組，用PCR方法檢測分離菌耐藥基因。大腸桿菌耐藥基因引物(表2)及PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[13]。
2結(jié)果與分析
2.1細(xì)菌的分離鑒定
2.1.1分離菌菌落形態(tài)與革蘭氏染色
分離菌在血瓊脂平板上培養(yǎng)，菌落有明顯β溶血環(huán)。在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離菌菌落呈紫黑色，有金屬光澤。在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)，分離菌菌落呈紅色。對分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢結(jié)果為革蘭氏染色陰性桿菌，兩端鈍圓。根據(jù)細(xì)菌菌落形態(tài)與革蘭氏染色鏡檢結(jié)果初步判定為大腸桿菌。
2.1.2生化特性鑒定
用ID32E腸道菌鑒定試條對分離菌進(jìn)行生化鑒定，并用ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行判定，生化鑒定結(jié)果顯示:d-葡萄糖、賴氨酸脫羧酶、L-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、d-半乳糖酸鹽同化、d-海藻糖、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、d-麥芽糖、蔗糖、酚紅檢測結(jié)果為陽性，經(jīng)ATB自動(dòng)生化鑒定儀分析結(jié)果為大腸桿菌。
2.1.3分離菌16SrDNA鑒定
將分離菌用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR檢測，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，將測序結(jié)果用NCBIBLAST進(jìn)行序列比對，分離菌與大腸桿菌屬同源性最高。
從GenBank上下載大腸桿菌屬參考菌株以及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的克雷伯菌屬(Klebsiella)、沙門菌屬(Salmonella)，以及巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)的巴氏桿菌屬(Pasteurella)參考菌株的16SrDNA序列，用Lasergene軟件的Megalign功能進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)分離菌與其他大腸桿菌屬參考菌株處于同一分支，與腸桿菌科的沙門參考菌株、克雷伯參考菌株屬于同一個(gè)大分支，而與巴氏桿菌科成員親近性相對較遠(yuǎn)。
2.1.4大腸桿菌血清型檢測
通過玻片凝集試驗(yàn)檢測分離菌，結(jié)果顯示分離菌為O89血清型大腸桿菌。結(jié)合鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定、16SrDNA基因測序分析的試驗(yàn)結(jié)果，判定分離菌為大腸桿菌，命名為LCE-1。
2.2致病性試驗(yàn)
將LCE-1菌以每只0.2mL菌液(菌液濃度為1.0×108cfu/mL)的劑量感染未懷孕小鼠，24h后LCE-1組小鼠全部死亡，對照組小鼠無死亡。對照組小鼠連續(xù)觀察2周，小鼠均無死亡，精神狀態(tài)良好，無任何病征。
將LCE-1菌以每只0.2mL菌液(菌液濃度為1.0×104cfu/mL)感染懷孕母鼠，24h后LCE-1組懷孕母鼠出現(xiàn)流產(chǎn)病征，精神萎靡。72h后5只LCE-1組母鼠全部流產(chǎn)，并有1只母鼠死亡。對照組懷孕小鼠無變化。10d后，對照組小鼠陸續(xù)正常分娩。
將死亡小鼠肝臟、脾臟、心臟，流產(chǎn)母鼠子宮細(xì)菌分離鑒定，同樣分離到大腸桿菌。
2.3毒力基因檢測
采用用PCR對LCE-1菌的毒力基因進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA6種毒力基因檢測陽性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明LCE-1攜帶多種毒力基因，其致病性可能與這6種毒力基因有關(guān)。
2.4藥物敏感性試驗(yàn)
采用K-B紙片法對LCE-1菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示:LCE-1對麥迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林、克林霉素、萬古霉素、紅霉素、米諾環(huán)素、多粘菌素B、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、青霉素、四環(huán)素共19種藥物耐藥;對哌拉西林、頭孢唑林、頭孢哌酮、羧芐西林、頭孢曲松、新霉素6種藥表現(xiàn)中敏;對環(huán)丙沙星、頭孢他啶、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星5種藥物表現(xiàn)敏感(表4)。其中，萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星為農(nóng)業(yè)部公告的禁用獸藥，只用于試驗(yàn)研究。分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，LCE-1菌多重耐藥性十分嚴(yán)重。
2.5耐藥基因檢測
用PCR對LCE-1菌的耐藥基因進(jìn)行檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示:四環(huán)素類(tetA、tetC、tetD)、β-內(nèi)酰胺類藥(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷類(aadA1、strA-strB)、磺胺類(sul1、sul2)耐藥基因檢測陽性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，LCE-1攜帶多種耐藥基因，進(jìn)一步解釋了為何LCE-1多重耐藥情況如此嚴(yán)重。
3討論
大腸桿菌為一種在自然條件下普遍存在的條件性致病菌，可感染多種家畜、家禽以及人類發(fā)病。動(dòng)物感染大腸桿菌后常出現(xiàn)腹瀉、敗血癥、免疫力降低等癥狀。本研究在秦皇島某貉養(yǎng)殖場懷孕母貉流產(chǎn)病因進(jìn)行診斷，對送檢流產(chǎn)胎兒進(jìn)行病毒(阿留申病毒、偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒)、寄生蟲(附紅細(xì)胞體、旋毛蟲、蛔蟲)、細(xì)菌(加德納氏菌、布氏桿菌、銅綠假單胞菌)檢測，結(jié)果均為陰性。但在肝臟、脾臟、心臟等臟器分離出1株優(yōu)勢菌株，該菌株菌落在血瓊脂平板有明顯β溶血環(huán)。通過伊紅美藍(lán)、麥康凱鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察菌落形，革蘭氏染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)初步判定為大腸桿菌。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定，16SrDNA序列分析，大腸桿菌血清型檢測，最終結(jié)果判定為大腸桿菌，血清型為O89型，并命名為LCE1。——論文作者：劉勃興趙安奇劉暢王利麗張雪佳吳同壘高桂生史秋梅*張志強(qiáng)