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摘 要： 摘要：為了解河北省秦皇島地區貉腸外致病性大腸桿菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC)的致病性與耐藥性，采取小鼠致病試驗、KB紙片法和PCR方法檢測20株貉源ExPEC對小鼠的致病力，對15種抗生素的敏感性以及12種毒力基因和15種耐藥基因的攜帶
摘要：為了解河北省秦皇島地區貉腸外致病性大腸桿菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC)的致病性與耐藥性，采取小鼠致病試驗、KB紙片法和PCR方法檢測20株貉源ExPEC對小鼠的致病力，對15種抗生素的敏感性以及12種毒力基因和15種耐藥基因的攜帶情況。結果顯示，20株ExPEC均可致小鼠死亡，死亡率在40%～80%;iss、ler、vat等11種毒力基因有不同程度檢出，檢出率為15%～85%;20株ExPEC均具有多重耐藥性，氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶等12種抗生素耐藥率均在70%以上，多西環素耐藥率高達100%(20/20);20株ExPEC分別檢出2～8個耐藥基因，喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB檢出率最高，為80%(16/20)。本試驗為秦皇島地區ExPEC所致貉大腸桿菌病的防制提供數據參考。
關鍵詞：貉;大腸桿菌;致病性;耐藥性
養貉業在我國毛皮動物養殖業中占據重要地位，但隨著貉的養殖規模逐漸擴大，貉的各種疾病頻發，嚴重制約著養貉業的健康發展[1]。在貉養殖過程中，貉大腸桿菌病十分常見，腸外致病性大腸桿菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，Ex-PEC)通常可引起貉肺炎、流產、神經系統損傷和敗血癥等[2-3]。有研究表明，在ExPEC致病過程中，毒力基因可通過質粒或溶原性噬菌體在不同菌屬之間水平傳播，嚴重威脅人與其他動物健康[4-6]。
目前，大腸桿菌病的防治以抗生素類藥物為主。但隨著對抗生素耐藥菌株的出現，給臨床治療帶來了困難，并且對抗生素耐藥的菌株還可通過多種途徑傳播，影響人與動物的公共衛生安全[7-8]。
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本試驗對2019年從河北省秦皇島地區分離的20株貉源ExPEC進行試驗研究，為秦皇島地區貉大腸桿菌病的防制以及ExPEC的致病性和耐藥性的相關機制研究奠定基礎。
1材料與方法
1.1菌株來源20株河北省秦皇島地區流行的貉源ExPEC(QHE1～20)為2019年由秦皇島市各縣的地方貉養殖場送檢疑似大腸桿菌病的病死貉，臨床癥狀以肺炎和神經癥狀為主，剖檢有明顯敗血癥。對送檢死貉的肝臟、肺臟、心臟等實質器官中的優勢細菌進行分離，經鑒定為大腸桿菌。
1.2主要試劑伊紅美藍培養基購自北京陸橋技術股份有限公司;DL2000plusDNAMarker購自中科瑞泰科技有限公司;藥敏紙片購自杭州天和微生物科技股份有限公司;2×TaqMasterMix細菌DNA基因組提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;昆明小鼠，體質量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
1.3菌株的復蘇將凍存的20株ExPEC分別在伊紅美藍培養基上三區劃線，于37℃恒溫培養箱培養12h，挑取有金屬光澤的單個菌落接種于LB液體培養基，37℃恒溫搖床培養12h。
1.4小鼠致病性試驗將1.3制備的純化菌液以1∶100的比例轉接至另一管LB液體培養基，37℃恒溫搖床培養至對數期，用無菌的PBS調整菌液濃度為1×107CFU/mL。每株ExPEC為1個感染組，每組5只小鼠，腹腔注射0.1mL調整濃度后菌液。設置對照組1組，5只小鼠分別注射0.1mL無菌PBS。觀察各組小鼠狀態，記錄小鼠發病及死亡情況，并剖檢死亡小鼠，分離實質器官細菌并鑒定。
1.5毒力基因檢測按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取20株ExPEC的DNA，以提取的DNA為PCR模板。參照文獻[9]合成血清抗性蛋白iss基因、腸細胞脫落位點毒力島(locusofen-terocyteeffacement，LEE)ler和eaeA基因、耶爾森強毒力島(highpathogenicityisland，HPI)irp2和fyuA基因，空泡形成素vat基因、溶血素基因hlyF、鐵攝取系統iucD和iroN基因、P菌毛黏附素papC基因、外膜蛋白ompT基因、Ⅰ型菌毛黏附素fimC基因引物，PCR檢測20株ExPEC的毒力基因并統計各菌株毒力基因攜帶情況。
1.6藥物敏感性試驗采取KB紙片法進行藥物敏感性試驗檢測，具體操作參照美國臨床和試驗室標準協會(CLSI)標準。試驗的抗生素分別為β-內酰胺類(氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林)，氨基糖苷類(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四環素類(多西環素、土霉素)，氟喹諾酮類(環丙沙星、恩諾沙星)，氯霉素類(氟苯尼考)，大環內酯類(替米考星)，磺胺類(磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復方新諾明)。試驗結果判定參照CLSI藥敏試驗標準。
1.7耐藥基因檢測按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取20株ExPEC的DNA，以提取的DNA為PCR模板。參照文獻[10]合成四環素耐藥基因tetA和tetC，磺胺類耐藥基因sul1和sul3，喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、gyrA和gyrB，β-內酰胺類耐藥基因ctx-M和SHV，氨基糖苷類耐藥基因addA1、strA和strB，大環內酯類耐藥基因er-mA和mefA引物，PCR檢測20株ExPEC的耐藥基因并統計各菌株耐藥基因攜帶情況。
2結果
2.1小鼠致病性試驗感染小鼠后，對各組小鼠持續觀察2周。感染組小鼠出現呼吸急促、紊亂，精神萎靡。各感染組小鼠死亡情況見表1。剖檢死亡小鼠，小鼠肝臟、肺臟有明顯出血點，腹腔有積液。對照組小鼠無死亡，狀態良好，無病征。分離感染組死亡小鼠肝臟、肺臟等器官細菌，經鑒定為大腸桿菌，生化鑒定等鑒定結果與感染菌株特征相近。
2.2毒力基因檢測毒力基因檢測結果顯示，20株ExPEC分別檢出1～10個毒力基因，具體見表1。12種毒力基因中，未檢出papC基因，其余11種毒力基因均檢出。各毒力基因檢出率見圖1，其中iu-cD基因檢出率最高，為85%(17/20)。試驗的20株ExPEC均攜帶毒力基因，各菌株所檢出的毒力基因組合形式較多。在致病性試驗中，感染小鼠后小鼠未全部死亡的菌株毒力基因檢出數要明顯少于全部死亡的菌株。
2.3藥物敏感性試驗藥物敏感性試驗結果顯示，20株ExPEC對多西環素耐藥率高達100%(20/20)，對頭孢曲松敏感率最高為40%(8/20)(表2)。分離菌的耐藥譜顯示，20株ExPEC分別對6～15種抗生素表現耐藥，對3類抗生素及以上多重耐藥菌株占比高達100%(20/20)(表3)，說明20株Ex-PEC耐藥表型較為復雜多樣。
2.4耐藥基因檢測耐藥基因檢測結果顯示，20株ExPEC分別攜帶2～8個耐藥基因(表4)。15種耐藥基因中，四環素類耐藥基因tetA和tetC，磺胺類耐藥基因sul1，大環內酯類耐藥基因mefA未檢出，其余10種耐藥基因有不同程度的檢出，喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB檢出率最高，均為80%(16/20)(圖2)，說明20株ExPEC的耐藥基因攜帶情況較為復雜。
3討論
ExPEC是一種能夠引起豬、牛、羊、雞等多種動物發病的人畜共患病原菌[11-12]。動物感染ExPEC后臨床表現復雜，毛皮動物感染后以肺炎、敗血癥為主，具有較高的死亡率[13]。國內外對于豬源、禽源ExPEC的相關報道居多，且致病菌株占比較高，而毛皮動物，尤其是貉源ExPEC相關報道較少。本試驗以小鼠為動物模型對20株ExPEC的致病力進行初步研究，結果顯示，20株ExPEC可致小鼠出現不同程度的死亡，且均具有致病力，表明秦皇島地區貉源ExPEC均具有一定的毒力，養殖過程應注意合理預防貉大腸桿菌病，減少經濟損失。但20株ExPEC致病力及其強弱還需進一步進行動物回歸試驗和LD50試驗驗證。
有研究表明，ExPEC毒力基因與其在動物宿主體內定植，逃逸甚至破壞宿主相關免疫系統，對宿主的致病性和自身遺傳進化有一定的相關性[5，14]。因此，通過對ExPEC的毒力基因進行研究，可進一步了解ExPEC的感染發病機制以及該地區致病菌的病原特征。在ExPEC的毒力基因中，以黏附因子、免疫逃逸和代謝相關毒力基因為主[15]。因此，本試驗選取上述3類毒力基因中研究較多的12種進行檢測。研究發現，20株貉源ExPEC共計檢出11種毒力基因且每種毒力基因檢出率不同。在所檢測的毒力基因中，iucD基因檢出率最高。iucD屬于iuc基因家族，該基因家族編碼氣桿菌素相關蛋白的合成[16]。氣桿菌素系統可增強細菌從宿主攝取鐵的能力，進而影響細菌的致病力[17-18]。有報道通過基因敲除技術構建了禽大腸桿菌iucD基因缺失株，并通過動物試驗驗證了iucD基因缺失降低禽源大腸桿菌的致病力，表明iucD基因與大腸桿菌的致病性有一定的相關性[19-20]。此外，李巧玲[10]報道秦皇島地區狐肺炎大腸桿菌iucD基因的檢出率為71.4%(55/77);賈青輝等[21]報道河北地區雞源致病性大腸桿菌iucD基因的檢出率為95.2%(99/104)，表明在河北地區，尤其是在秦皇島地區，動物源ExPEC中iucD基因較為流行。本試驗毒力基因數攜帶多的菌株小鼠死亡率明顯高于攜帶數少的菌株，在馬增軍等[22]和朱利霞等[23]的研究中，同樣出現過該現象，但兩者是否有明顯的相關性還有待考證。
抗生素類藥物在大腸桿菌病的防治中有著重要地位，但在臨床治療過程中，由于致病菌產生了耐藥性，導致某些抗生素類藥物的療效銳減或無效;因此，了解當地致病菌的耐藥表型并指導臨床用藥對相關細菌病的防控具有重要意義。本試驗選取臨床常用的15種抗生素藥物進行試驗，結果顯示，20株ExPEC均對3類以上抗生素多重耐藥性，且不同菌株耐藥表型有一定的差別。15種抗生素中，20株ExPEC對多西環素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶等12種抗生素耐藥率在70%以上，對多西環素耐藥率高達100%(20/20)，表明上述12種抗生素對20株ExPEC的治療效果較差，臨床用藥時應選用敏感度較高的頭孢曲松、氨芐西林等治療。據馮濤等[24]報道，黑龍江和吉林兩省貉源大腸桿菌對頭孢噻吩、氨芐西林和四環素耐藥率較高，與本試驗結果有較大差別;據高光平等[25]報道，秦皇島市昌黎縣的狐和貉源大腸桿菌對土霉素、多西環素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶等耐藥性較高，與本試驗結果相近，表明不同地區貉源大腸桿菌對抗生素的耐藥性表型不同，同一地區貉源大腸桿菌的耐藥表型相近，這可能與地方用藥情況有關。因此，臨床應注意合理用藥，避免耐藥性的產生，并實時監控地方流行致病菌株的耐藥情況，可有效地防制相關細菌病。
細菌耐藥性的產生分為固有耐藥和獲得耐藥兩類，而后者被認為是耐藥性產生的主要原因[26]。細菌的耐藥基因可通過質粒、整合子、轉座子等移動基因元件在不同菌株之間轉移，使菌株獲得耐藥性。本試驗選取目前研究最多的6類15種耐藥基因進行檢測，結果顯示，20株ExPEC分別檢出2～8個耐藥基因，不同菌株耐藥基因攜帶情況有一定的不同。除四環素類耐藥基因tetA和tetC，磺胺類耐藥基因sul1，大環內酯類耐藥基因mefA，其余11種耐藥基因均有檢出。在檢出的耐藥基因中，喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB檢出率最高。DNA回旋酶的2個A、B亞基分別由gyrA、gyrB基因編碼，這2個基因突變導致喹諾酮類藥物作用靶位改變，降低了喹諾酮類藥物的結合率使細菌耐藥[27]。在本試驗中，喹諾酮類抗生素環丙沙星和恩諾沙星這2種藥物的耐藥率同樣很高，表明細菌耐藥性的產生與耐藥基因存在一定的相關性。但四環素類、大環內酯類和磺胺類抗生素的耐藥基因檢出率與耐藥率符合率較低，分析其原因有：細菌耐藥性的產生是由多個基因和多重機制共同作用的結果，本試驗僅選取目前較為常見的幾種耐藥基因進行調查;耐藥基因與藥物敏感性試驗等耐藥性試驗檢測技術有一定的誤差。本試驗對秦皇島地區貉源ExPEC的耐藥性和耐藥基因攜帶情況進行了初步研究，為后續貉源ExPEC耐藥性產生原因的機制研究以及臨床合理應用抗生素提供依據。——論文作者：劉勃興△，趙安奇△，柳翠翠，付祥，劉暢，李浩，史秋梅*，張志強*