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摘 要： 摘要:本研究采用鄰苯二甲醛法從柏式中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內(nèi)臟中篩選出一株具高效降解膽固醇功能的乳酸菌HJ-S2，利用16SrDNA分子生物學(xué)和API50CH系統(tǒng)鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。為提高乳酸菌HJ-S2體外降膽固醇能力，考察了菌株的
摘要:本研究采用鄰苯二甲醛法從柏式中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內(nèi)臟中篩選出一株具高效降解膽固醇功能的乳酸菌HJ-S2，利用16SrDNA分子生物學(xué)和API50CH系統(tǒng)鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。為提高乳酸菌HJ-S2體外降膽固醇能力，考察了菌株的生長特性，并從培養(yǎng)基條件和發(fā)酵條件兩個(gè)方面，采用單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件為:蛋白胨含量5g/L，葡萄糖含量25g/L，膽固醇含量1.0g/L，膽鹽含量2.0g/L;發(fā)酵條件為:溫度37℃，pH6，培養(yǎng)時(shí)間24h，接種量1%。在此優(yōu)化條件下，膽固醇降解率達(dá)到69.81%，較優(yōu)化前有顯著提升，為功能性益生菌制劑的開發(fā)應(yīng)用提供生產(chǎn)工藝及參考依據(jù)。
關(guān)鍵詞:海洋生物學(xué);植物乳桿菌;降膽固醇;喙鯨;發(fā)酵工藝優(yōu)化
膽固醇在人體內(nèi)具有重要的生理作用，是人體合成荷爾蒙以及組成神經(jīng)細(xì)胞不可缺少的重要物質(zhì)[1]，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成類固醇激素、VD3及膽汁酸等物質(zhì)。流行病學(xué)和臨床研究表明，血清膽固醇水平和心腦血管疾病的發(fā)生呈明顯正相關(guān)性，血清膽固醇水平每高出正常水平1mmol，導(dǎo)致心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)便增加約35%[2]。營養(yǎng)學(xué)家推薦食物膽固醇的攝入量為每人每天250～300mg，攝入過多會(huì)使血清中的膽固醇升高，誘發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[3-4]。因此研究開發(fā)具有降膽固醇效果的藥品、保健品及食品已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。
乳酸菌(LacticAcidBacteria，LAB)是指一群發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱，是公認(rèn)的安全微生物[5]。近些年的研究表明，定殖于腸道中的有益乳酸菌群具有多種保健作用:維持微生態(tài)平衡和腸道機(jī)能、降低血清膽固醇、緩解乳糖不耐癥、改善肝功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等[6]。Oh等(2015)通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從傳統(tǒng)發(fā)酵的小米酒中分離所得乳酸菌有作為益生菌制劑用于發(fā)酵工業(yè)的潛在用途[7]。李昵等(2012)、蒲博等(2014)、丁苗等(2014)證實(shí)了乳酸菌在體內(nèi)的降解膽固醇功能[8-10]。Zhang等(2016)對降低蛋黃膽固醇的復(fù)合乳酸菌劑(嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilus、嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus、雙歧桿菌Bifidobacterium)進(jìn)行了工藝優(yōu)化[11]。付永巖等(2019)優(yōu)化了3株具降膽固醇能力乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基條件，為菌體高密度培養(yǎng)提供依據(jù)[12]。目前所報(bào)道的降膽固醇乳酸菌大多來自陸源，而海洋源乳酸菌則鮮有報(bào)道。
本研究對海平面300m以深海洋哺乳動(dòng)物柏氏中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內(nèi)臟中的乳酸菌進(jìn)行了降膽固醇活性篩選，并根據(jù)篩選所得菌株的生長特性及培養(yǎng)基條件、發(fā)酵條件兩個(gè)方面采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)，獲得其對降膽固醇的優(yōu)化條件，為海洋源功能性益生菌制劑的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1樣品與試劑
樣品取自2017年10月擱淺于福建省寧德蕉城區(qū)(三都澳青山海域)的柏式中喙鯨的腸道內(nèi)含物。無菌操作取樣后將樣品送至本實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
蛋白胨購自生工生物工程(上海)有限公司;眎蛋白胨購自青島海博生物技術(shù)有限公司;菊糖購自阿拉丁試劑有限公司;胰蛋白胨、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、膽固醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛購自麥克林試劑公司;可溶性淀粉、吐溫80購自西隴化工股份有限公司;試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2培養(yǎng)基
MRS培養(yǎng)基(1L):蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.2g、吐溫801.0mL、葡萄糖20g，蒸餾水定容至1L。調(diào)節(jié)pH到6.4左右，121℃滅菌20min。
MRS-CHOL培養(yǎng)基(1L):在上述MRS培養(yǎng)基礎(chǔ)上添加膽固醇1.0g，吐溫8020mL，牛膽鹽3.0g。將1.0g膽固醇置于20mL吐溫80中，加熱至沸騰后使其溶解，趁熱緩慢倒入培養(yǎng)基中，呈膠束溶液狀態(tài)，此時(shí)培養(yǎng)基的顏色呈不透明淡黃色。配制好的培養(yǎng)基在121℃滅菌20min后趁熱將試管晃動(dòng)或上下顛倒振蕩，以使該膠狀物完全溶解，置于室溫中自然冷卻，放置備用。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1菌株分離純化及降膽固醇功能的篩選將樣品混合適量無菌水研磨均勻，吸取1mL研磨液轉(zhuǎn)移至裝有含9.0mL0.9%滅菌生理鹽水的試管中，振蕩搖勻。從1×10-1到1×10-6進(jìn)行梯度稀釋并吸取0.15mL研磨稀釋液涂布于MRS(含碳酸鈣)平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃厭氧培養(yǎng)36～72h。根據(jù)菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等，挑取有透明圈的單菌落于MRS平板上進(jìn)行多次劃線純化，記錄菌落形態(tài)特征。將純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，凡是革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陰性的菌株疑似為乳酸菌。純化后菌株接種于MRS斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
采用鄰苯二甲醛法[13]對待測菌進(jìn)行降膽固醇能力的篩選。將疑似乳酸菌連續(xù)活化2次后，按2%接種量接種到MRS-CHOL液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h后取1mL發(fā)酵菌液，離心(8000r/min)10min后取上清液采用鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量，按公式(1)計(jì)算降膽固醇率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
式(1)中:A0、A1分別為未接菌上清液和菌株發(fā)酵上清液的膽固醇質(zhì)量含量(mg/mL)。
1.3.2菌株HJ-S2的分子鑒定挑取保存于平板上2～3個(gè)菌落混合于API50CH培養(yǎng)基中，制得渾濁度相當(dāng)于2McFarland的菌懸浮液，將此菌懸浮液依次加入API50CH試劑條的孔中，用甘油覆蓋保持厭氧環(huán)境，底盤加10mL水使其保持濕潤的氣體環(huán)境，隨后將試劑條浮于水上，37℃培養(yǎng)48h觀察各糖類發(fā)酵情況。結(jié)果經(jīng)API-plus軟件分析發(fā)酵糖種類確定其菌屬。
采用試劑盒提取細(xì)菌DNA，并利用16SrDNA通用引物(27F，1492R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到清晰的條帶。菌株P(guān)CR產(chǎn)物送至上海生工有限公司測序，并將測序結(jié)果與GenBank各標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST比對，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，完成乳酸菌的分子鑒定。
1.3.3菌株生長特性的測定取保存的菌種，在無菌條件下接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后按2%的接種量連續(xù)活化兩次，得乳酸菌菌懸液。將活化后的菌株HJ-S2按2%接種量接入500mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)。測定初始培養(yǎng)基的OD600，前期10h每間隔1h測定培養(yǎng)液的OD600和pH值，后期每間隔3h測定培養(yǎng)液的OD600和pH值，連續(xù)測定48h，繪制菌株HJ-S2的生長曲線及pH值變化。
1.3.4培養(yǎng)基條件對膽固醇降解率的影響分別用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨以等量代替MRS-CHOL培養(yǎng)基的蛋白胨，將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含不同氮源的MRS-CHOL培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h，按“1.2.1”的方法測定不同種類氮源對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。選出確定的氮源后，進(jìn)一步考察氮源添加量對降解率的影響。
分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、菊糖代替MRS-CHOL培養(yǎng)基中的葡萄糖，測量方法同上，考察不同碳源及添加量對降解率的影響。
將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含膽固醇含量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL的MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h，測定不同膽固醇含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含牛膽鹽含量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的MRSCHOL培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h，測定不同牛膽鹽含量對HJ-S2膽固醇降解率的影響。
1.3.5不同發(fā)酵條件對膽固醇降解率的影響
以“1.3.4”實(shí)驗(yàn)中所確定的MRS-CHOL培養(yǎng)基的各成分含量，將活化后的菌株HJ-S2按2%接種量接種于MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)54h，每6h取培養(yǎng)液，測定不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
菌株HJ-S2活化后按2%接種量接種于MRSCHOL培養(yǎng)基中，分別于37℃、38℃、40℃、41℃、42℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h，測定不同培養(yǎng)溫度對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
菌株HJ-S2接種于初始pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10的MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h，測定不同初始pH對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
菌株HJ-S2按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種于MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h，測定不同接種量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
1.3.6培養(yǎng)基、發(fā)酵條件正交試驗(yàn)為了確定最佳的液體培養(yǎng)基配方，依據(jù)前期單因素條件對菌株HJ-S2膽固醇降解率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及細(xì)菌生長所需營養(yǎng)要素的基本原則，以膽固醇降解率為指標(biāo)，分別設(shè)計(jì)葡萄糖、蛋白胨、膽固醇、膽鹽含量4因素3水平正交試驗(yàn)及pH、培養(yǎng)時(shí)間和接種量3因素3水平正交試驗(yàn)。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
采用Excel2013軟件分析數(shù)據(jù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次;采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)p<0.05時(shí)，差異被認(rèn)為是有意義的，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;采用Origin8.0和Excel2013進(jìn)行繪圖。
2結(jié)果與討論
2.1乳酸菌的分離純化及降膽固醇功能篩選
從喙鯨內(nèi)臟共分離純化出30個(gè)單菌落，生理生化實(shí)驗(yàn)及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，該30株菌為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)為透明、白色或黃色且邊緣規(guī)則，油鏡下觀察菌體形態(tài)為球狀或桿狀，過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性，符合乳酸菌屬的特征。將所得乳酸菌進(jìn)行降膽固醇能力篩選實(shí)驗(yàn)，其中降解率小于10%的有6株菌，10%～20%的有8株菌，>20%～30%的有8株菌，>30%～40%的有5株菌，40%以上的有3株菌(HJ-W33、HJ-W64、HJ-S2)，降解率分別為40.69%、40.78%、48.82%，其中HJ-S2(CGMCCNo:17720)的降解率最高為48.82%，具有較高的潛在研究價(jià)值(表1)。
2.2具降膽固醇功能乳酸菌的鑒定
對菌株HJ-S2進(jìn)行API50CH碳水化合物發(fā)酵鑒定，將發(fā)酵結(jié)果(表2)輸入API數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，后續(xù)為了使鑒定結(jié)果更精準(zhǔn)，結(jié)合16SrDNA序列分析進(jìn)行分子水平的鑒定。
菌株HJ-S2的PCR產(chǎn)物大小為1.5kb左右，符合16SrDNA序列長度。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與已知標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行同源性對比，BLAST結(jié)果顯示該菌株的序列與登錄號(hào)為LC379973.1、CP0237771.1以及MH779888.1等植物乳桿菌的16SrDNA基因組序列相似性均為100%，證實(shí)了菌株HJ-S2為植物乳桿菌L.plantarum(GenBank登錄號(hào)MK248728)。使用MEGA7.0軟件構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。
2.3菌株的生長特性菌株
HJ-S2的生長特性如圖2所示。前期0～3h是生長延滯期，該階段菌株適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，繁殖緩慢，數(shù)量增長較少，OD600由0.25緩慢上升至0.38，pH值從初始培養(yǎng)基的6.10下降至5.63。3～24h是菌株生長對數(shù)期，該階段細(xì)菌代謝和繁殖快速增長，生長迅速，細(xì)菌數(shù)呈對數(shù)式生長，OD600由0.38迅速上升至1.65，pH值迅速從5.63下降至3.72左右。24～34h為菌株生長的穩(wěn)定期，其間活菌數(shù)達(dá)到最大值且基本保持不變，菌體代謝和繁殖平衡，代謝產(chǎn)物持續(xù)積累，OD600維持在1.65左右，此時(shí)酸性代謝產(chǎn)物趨于穩(wěn)定，體系pH值穩(wěn)定在3.70左右。34～48h是菌株的衰亡期，該階段活菌數(shù)略有降低，部分菌株衰老死亡，且菌株活性降低并趨于停滯，OD600從1.65降至1.50左右且具持續(xù)緩慢降低的趨勢，菌體的凋亡使部分酸性代謝產(chǎn)物減少，pH值略有回升，從3.70回升至3.90左右。由此可見，菌株HJ-S2生長速率較快且產(chǎn)酸能力強(qiáng)，適合發(fā)酵法制備功能性微生態(tài)制劑。
2.4不同氮源和碳源對膽固醇降解率的影響
考察不同氮源對膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖3(a)所示。同一菌株在含不同氮源的MRS-CHOL培養(yǎng)基中膽固醇降解率差異顯著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中膽固醇降解率最高，胰蛋白胨略低，眎蛋白胨較低，大豆蛋白胨最低。此外，蛋白胨價(jià)格也相對較低，綜合考慮選擇蛋白胨作為發(fā)酵氮源。進(jìn)一步對考察不同蛋白胨添加量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結(jié)果如圖3(b)所示，氮源含量對菌株的膽固醇降解率有一定影響。當(dāng)?shù)鞍纂撕繛?0g/L，降解率最高，達(dá)到39.28%;當(dāng)繼續(xù)提高蛋白胨的添加量，降解率有所下降，維持在25.80%左右，由此確定正交試驗(yàn)水平為蛋白胨含量5、10、15g/L。
考察不同碳源對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響結(jié)果如圖3(a)所示。菌株在含不同碳源的MRS-CHOL培養(yǎng)基中膽固醇降解率差異顯著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中膽固醇降解率最高，乳糖、麥芽糖、菊糖次之，而可溶性淀粉作為碳源時(shí)降解率最低。葡萄糖作為單糖，微生物能很好地直接吸收利用，因此選擇葡萄糖作為發(fā)酵碳源。
進(jìn)一步考察葡萄糖不同添加量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結(jié)果圖3(b)所示。當(dāng)葡萄糖添加量為20g/L時(shí)，菌株HJ-S2對膽固醇的降解率最高，達(dá)到42.13%，當(dāng)繼續(xù)提高葡萄糖的添加量，降解率反而下降維持在29.30%左右。因?yàn)樘荚春窟^高使菌體生長過快，過早衰老發(fā)生自溶，從而影響菌體對膽固醇的吸收[14]。由此確定正交試驗(yàn)中葡萄糖含量為15、20、25g/L。
2.5膽固醇、膽鹽含量對膽固醇降解率的影響
不同膽固醇含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(a)所示。菌株HJ-S2對膽固醇的降解率隨膽固醇含量的升高先增大后減少，當(dāng)膽固醇含量為1.0g/L時(shí)，降解率達(dá)到最大值為38.94%，隨著膽固醇含量的增加，降解率略有降低，后續(xù)維持在26.13%左右。由此確定正交試驗(yàn)中膽固醇含量為0.5、1.0、1.5g/L。
不同膽鹽含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(b)所示。菌株HJ-S2對膽固醇的降解率隨膽鹽含量升高先增大后減少，膽鹽含量為1.0g/L時(shí)，膽固醇降解率較低為18.62%;當(dāng)膽鹽含量為2.0g/L時(shí)，降解率達(dá)到最大值為43.99%;膽鹽含量達(dá)到3.0g/L時(shí)，膽固醇降解率達(dá)到了38.62%左右，隨著膽鹽含量的升高，膽固醇降解率也相應(yīng)減小后續(xù)維持在37.51%左右。由此確定正交試驗(yàn)中膽鹽含量為1.5、2.0、2.5g/L。
2.6發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度對膽固醇降解率的影響
發(fā)酵時(shí)間對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(c)所示，結(jié)合菌株生長曲線進(jìn)行分析，0～3h為菌株的生長延滯期，菌體適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，繁殖緩慢，數(shù)量增長較少，此階段膽固醇降解率較低;3～24h為菌株的對數(shù)生長期，此階段細(xì)菌數(shù)量呈指數(shù)增長，細(xì)菌代謝繁殖快速增長，培養(yǎng)基中膽固醇含量急劇下降，當(dāng)培養(yǎng)到24h時(shí)，膽固醇降解率達(dá)到最大42.18%;24～34h為乳酸菌生長的穩(wěn)定期，膽固醇降低率不再增加且略有下降;34～54h為菌株的衰亡期，部分菌體衰老死亡，膽固醇降低率逐漸穩(wěn)定在32.15%左右。
不同培養(yǎng)溫度對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結(jié)果如圖4(d)所示。不同培養(yǎng)溫度對菌株的降膽固醇能力有一定影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度為34℃時(shí)，膽固醇降解率最低為25.82%左右;當(dāng)溫度為37℃時(shí)，菌株HJ-S2對膽固醇降解率最高達(dá)41.39%且與38℃時(shí)的降解率相差不大;溫度達(dá)到40℃以上時(shí)，使菌體活性相應(yīng)降低，影響菌體對膽固醇的吸收從而使膽固醇降解率稍有降低。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)一直在37℃進(jìn)行分離培養(yǎng)，且菌體的最適溫度為37℃，溫度過低或過高都會(huì)影響菌體的生物活性。——論文作者：萬婧倞，羅曼，吳鵬，黃仕新，唐旭*，徐長安
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