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摘 要： 摘 要：為了解雞肺臟不同時期的免疫狀態，本實驗選擇不同日齡的海蘭白雞的肺臟組織，利用免疫組織化學方法研究 MHC-Ⅱ+細胞的出現、定位分布及數量變化過程。結果顯示，MHC-Ⅱ+細胞最初于胚胎13d出現。胚胎13d至18d期間，MHC-Ⅱ+細胞數量有所增多，并主要分
摘 要：為了解雞肺臟不同時期的免疫狀態，本實驗選擇不同日齡的海蘭白雞的肺臟組織，利用免疫組織化學方法研究 MHC-Ⅱ+細胞的出現、定位分布及數量變化過程。結果顯示，MHC-Ⅱ+細胞最初于胚胎13d出現。胚胎13d至18d期間，MHC-Ⅱ+細胞數量有所增多，并主要分布在三級支氣管的肺房房間隔中。1日齡時，MHC-Ⅱ+細胞在小葉間結締組織中也有分布。4日齡時，在初級支氣管與次級支氣管交匯處有淋巴細胞的聚集物，即形成了明顯的支氣管相關性淋巴組織(BALT)，此時 BALT 中的大多數細胞都表達 MHC-Ⅱ，成為主要的細胞群體。7至14日齡時，MHC-Ⅱ+細胞數量逐漸增加，在呼吸性毛細管管壁上出現較多的 MHC-Ⅱ+細胞。21至90日齡時，無論是 BALT 中，還是肺小葉中 MHC-Ⅱ+細胞的數量都持續增加，并且遍布于整個肺臟。結果表明，雞肺臟中 MHC-Ⅱ+細胞的分布和數量均呈現日齡相關性變化，并且其變化可以反映出胚胎期及出殼初期肺臟中抗原呈遞細胞較少，隨后日齡顯著增多，從而進行有效的抗原遞呈，參與免疫應答。
關鍵詞：雞;肺臟;MHC-Ⅱ+細胞;抗原呈遞細胞;分布
目前，家禽的呼吸道疾病如禽流感和新城疫等給家禽養殖業帶來了巨大的損失，而肺臟又是家禽許多病毒性和細菌性疾病的主要靶器官，病原體會通過肺呼吸系統黏膜表面進入宿主，然后進一步散布到其他器官中。因此，動物的健康在很大程度上取決于是否能夠成功控制病原在肺臟組織尤其是肺臟支氣管黏膜表面的入侵和復制。抗原呈遞細胞(Antigen-presentingcells，APC)是指能夠攝取、加工處理抗原，并將處理過的抗原呈遞給 T、B淋巴細胞的一類免疫細胞。研究表明，肺臟中的 APC 在肺免疫性疾病，如哮喘、特發性纖維化及病毒感染等疾病中具有重要的免疫學意義。主要組織相容性復 合 體 II類 分 子 (majorhistocompatibilitycom-plex-II，MHC-II)是免疫系統的重要組成部分，主要表達在抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞和巨噬細胞上，負責抗原遞呈，在自我識別的機體系統中使特異性 T 淋巴細胞檢測到外來抗原。因此，MHC-II分子是抗原呈遞細胞膜表面的主要細胞識別標志。
孵化期間由蛋殼氣孔過濾后的氣體是禽類的氧氣供應源。出殼之后，雛禽開始接觸外界空氣，并逐漸適應外界環境，同時其呼吸道結構和功能也得到發育和建立。出殼初期為了適應外界環境，雞的肺臟也經歷著相應的快速變化。伴隨著肺臟結構和功能的一系列轉變，肺臟的免疫功能也應發生著相應的變化，其中抗原呈遞細胞的發育及呈遞功能的發生至關重要，將決定是否能夠及時并有效的產生免疫應答。因此本研究采用免疫組織化學方法研究從雞胚到出殼后的不同生長發育階段，肺臟中 MHC-II+細胞的發育情況以及定位分布變化，從而反映發育時期雞肺臟的免疫狀態變化，為進一步研究家禽肺臟的免疫機制奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 試驗動物
200個海蘭褐 SPF種蛋，購自吉林卓越生物科技有限 公 司。種 蛋 進 行 常 規 孵 化，雛 雞 進 行 常 規飼養。
1.2 主要試劑及用具
冰凍切片用 OCT 組織包埋液購自美國 Sakura公司;小 鼠 抗 雞 MHC-II 單 克 隆 抗 體 購 自 美 國SouthernBiotechnology 公 司;UltraSensitiveSP超敏試劑盒kit9901購自福州邁新公司。
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依愛 EIF/C.DME3456 孵化機/出雛機(廣東依愛孵化機廠生產)，LeicaCM1850 冰凍切片機(德國 Leica公司生產)，OlympusCX41 顯微鏡(日本Olympus公司生產)，Pixerapro150ES圖像采集器(美國 Pixera公司生產)。
1.3 試驗設計
200個海蘭褐 SPF種蛋進行孵化，雞出殼后置于動物室中常規飼養。分別選擇未經過疫苗免疫的11、13、15、18、20日胚齡雞胚，1、4、7、14、21、35、56和90日齡的雛雞，每個時期取3只雞胚或雛雞的肺臟組織。將肺臟組織制成冰凍切片，片厚5μm，于-80 ℃保存備用。
1.4 免疫組織化學染色程序
每張切片滴加30ml/L 過氧化氫，室溫下孵育10min;PBS洗3次，每次3min;除去PBS，每張切片分別滴加小鼠抗雞 MHC-II單克隆抗體工作液，37 ℃孵育1h;PBS洗3次，每次3min;每張切片滴加聚合物增強劑(試劑 A)，室溫下孵育20min;PBS洗3次，每次3min;每張切片加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑 B)，室溫下孵育30min;PBS洗3次，每次3min;DAB顯色;蘇木精復染;自來水沖洗返藍;梯度酒精脫水;二甲苯透明;中性樹脂封片;照相。
1.5 圖像分析及統計學處理
應用Image-proplus6.0圖像分析軟件測定肺臟中單位視野內陽性細胞面積。每張切片測3個視野，取平均值。應用 SPSSl8.0軟件對不同日齡的同一陽性細胞進行單因素方差分析。
2 結果
2.1 胚胎期肺臟中 MHC-Ⅱ+細胞的分布規律
13日 胚 齡，MHC-Ⅱ + 細 胞 已 經 出 現 在 肺 臟中，由于此時肺臟的組織結構仍處于發育早期，很難辨別 MHC-Ⅱ+細胞分布的準確位置，似乎是出現在大的肺內導管-初級支氣管或次級支氣管周圍(圖1A)。
15日胚齡，各種免疫細胞中也只有 MHC-Ⅱ+細胞存在，而且數量明顯增多，而且分布范圍變廣，較多地分布于由三級支氣管管壁內陷所剛剛形成的肺房的房間隔中(圖1B)。
18日胚齡與20日胚齡的發育狀況相近，分布在房間隔上的 MHC-Ⅱ+細胞繼續增多(圖1C)。
2.2 出 殼 后 初 期 肺 臟 中 MHC-Ⅱ + 細 胞 的 分 布規律
1 日 齡 時，MHC-Ⅱ + 細 胞 數 量 繼 續 增 多，MHC-Ⅱ+細胞除分布在房間隔上外，還在小葉間結締組織中有分布(圖1D)。
4日齡時，通過免疫組織化學染色可見，在初級支氣管與次級支氣管交匯處有淋巴細胞的聚集物，即形成了明顯的支氣管相關性淋巴組織(BALT)。從此時起，肺臟內的淋巴細胞就以兩種形式存在，一是集合性淋巴組織—BALT，另外就是散布在肺小葉中的彌散性淋巴組織。此時 BALT 中的大多數細胞 都 表 達 MHC-Ⅱ，成 為 主 要 的 細 胞 群 體 (圖1E)。除了形成 BALT 外，肺臟肺小葉中的各種免疫細胞的數量也較之前日齡明顯增加，MHC-Ⅱ+細胞開始分布在三級支氣管氣道內壁中(圖1F)。
7日齡時，BALT 更為發達，MHC-Ⅱ+細胞在房間隔和小葉間結締組織中也有大量分布(圖1G)。
14日齡時，呼吸性毛細管管壁上的出現較多的MHC-Ⅱ+細胞(圖1H)。2.3 21-90 日 齡 肺 臟 中 MHC-Ⅱ + 細 胞 的 分 布規律
21日齡時，BALT 特別發達，其中 MHC-Ⅱ+細胞數量顯著增加(圖2)，而且除了BALT 中之外，MHC-Ⅱ+細胞已遍布全肺(圖1I)。35日 齡 時，無 論 是 BALT 中，還 是 肺 小 葉 中MHC-Ⅱ+細胞的數量都持續增加(圖1J，圖2)。
56和90日齡時，MHC-Ⅱ+細胞的分布部位和數量與35日齡時基本一致，無明顯變化(圖1K，圖1L，圖2)。
3 討論
在禽類養殖中，呼吸系統的疾病是影響養殖的疾病之一，給養殖業也帶來了很大的經濟損失。目前，對黏膜表面進行疫苗接種是阻止致病菌的入侵機體的主要方法，如滴鼻點眼和噴霧等接種方法。為了研制適合雞使用且可以提供有效免疫保護的黏膜新型疫苗，就需要對雞肺臟相關免疫系統的結構和功能的有綜合的了解。但目前還缺乏有關雞肺相關免疫系統的知識。
抗原呈遞細胞尤其是樹突狀細胞是肺臟免疫微環境的重要組成部分和免疫前哨細胞，它與其它免疫活性細胞共同構成了肺臟的免疫屏障，具有免疫監視及誘導免疫應答反應的作用，同時也是特異性和非特異性免疫反應最重要的調節細胞。研究表明，大鼠肺臟樹突狀細胞在胚胎及出生時處于發育不完善狀態，包括數量偏少，MHC-II分子表達過低，處理抗原提呈功能較弱等，與成年鼠的水平存在差距，這可能是幼鼠呼吸道抵抗力低下的重要因素。本研究發現，13 日胚齡時，MHC-Ⅱ + 細胞已經較早地出現在肺臟中，由于此時肺臟的組織結構仍處于發育早期，很難辨別 MHC-Ⅱ+細胞分布的準確位置，似乎是出現在大的肺內導管-初級支氣管或次級支氣管周圍。隨后胚胎期各日齡以及出殼后1日齡，MHC-Ⅱ+細胞數量隨有所增加，但并不顯著，這也在一定程度上證明雞在胚胎期以及剛出殼時由于缺少抗原呈遞細胞而導致呼吸道免疫力低下，容易受到病原菌的侵擾。——論文作者：張英楠1，2，張桂山1，徐 晶1，楊樹寶1，3，*