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摘 要： 摘 要: 相對(duì)于動(dòng)物和微生物而言，流式細(xì)胞術(shù)在植物科學(xué)上的應(yīng)用會(huì)因植物組織與細(xì)胞( 如細(xì)胞壁、中央液泡、特殊細(xì)胞器等) 的特殊結(jié)構(gòu)以及次生代謝產(chǎn)物等特殊成分，造成樣品在前期處理、染色及測(cè)試等方面的困難，甚至導(dǎo)致檢測(cè)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。筆者在長(zhǎng)期運(yùn)用流式細(xì)胞儀
摘 要: 相對(duì)于動(dòng)物和微生物而言，流式細(xì)胞術(shù)在植物科學(xué)上的應(yīng)用會(huì)因植物組織與細(xì)胞( 如細(xì)胞壁、中央液泡、特殊細(xì)胞器等) 的特殊結(jié)構(gòu)以及次生代謝產(chǎn)物等特殊成分，造成樣品在前期處理、染色及測(cè)試等方面的困難，甚至導(dǎo)致檢測(cè)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。筆者在長(zhǎng)期運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)試工作中，積累了大量的植物樣本檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，并參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)出從植物取材、樣品制備到植物細(xì)胞核 DNA 流式檢測(cè)的方法和技巧，可為植物科學(xué)研究者及從事流式細(xì)胞檢測(cè)的技術(shù)人員提供實(shí)驗(yàn)參考。
關(guān)鍵詞: 流式細(xì)胞術(shù); 高等植物; 細(xì)胞核 DNA 含量; DNA 解離液
流式細(xì)胞儀( flow cytometer) 的誕生標(biāo)志著在單細(xì)胞水平上定性、定量分析及分選檢測(cè)技能的快速發(fā)展，并在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)研究及臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。但在植物學(xué)研究領(lǐng)域中，由于植物組織與細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)中的應(yīng)用滯后于其它學(xué)科。近 30 年來(lái)，隨著流式細(xì)胞儀多功能開(kāi)發(fā)、多參數(shù)流式分析與分選技術(shù)建立、流式樣品制備技術(shù)的不斷更新，流式細(xì)胞術(shù)在植物科學(xué)領(lǐng)域如植物遺傳育種、植物染色體分析與文庫(kù)構(gòu)建、逆境植物學(xué)、植物分類(lèi)學(xué)、植物病理學(xué)等各個(gè)學(xué)科中顯示出廣闊的應(yīng)用前景[1]。
大多數(shù)生物體遺傳信息編碼的 DNA 定位于細(xì)胞核，DNA 含量的檢測(cè)技術(shù)是開(kāi)發(fā)最早、應(yīng)用最廣泛、最基本的流式細(xì)胞術(shù)之一[2，3]。Galbraith 等[2]和 Hare 等[4]研究開(kāi)發(fā)了流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物細(xì)胞核 DNA 含量的方法，從而促進(jìn)了植物學(xué)前所未有的發(fā)展。流式細(xì)胞儀檢測(cè) DNA 含量的原理是利用特殊的熒光染料( PI、DAPI、AO 等) 與細(xì)胞內(nèi) DNA 堿基結(jié)合，在一定的壓力下染色細(xì)胞進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，經(jīng)激光照射后發(fā)射出熒光，通過(guò)濾片可收集到每個(gè)細(xì)胞相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度即可推算出細(xì)胞的 DNA 含量。流式細(xì)胞術(shù)不僅能對(duì)植物細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)基因組大小、DNA 含量及其倍性水平、物種入侵能力，還能分選出不同周期不同時(shí)期的細(xì)胞、染色體及構(gòu)建文庫(kù)等，這為植物細(xì)胞生物學(xué)研究提供了有力的工具及檢測(cè)手段。
利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)植物細(xì)胞核 DNA 含量和倍性，對(duì)描述物種特征、分類(lèi)及遺傳學(xué)研究都十分重要。我們?cè)跈z測(cè)植物樣品時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到大量 DNA 碎片的干擾，主要原因是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)( 如細(xì)胞壁、中央液泡) 及成分( 次生代謝產(chǎn)物等) 的特殊性和復(fù)雜性。筆者在長(zhǎng)期運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)試的工作中，積累了豐富的植物樣本檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)參考大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)植物樣品檢測(cè)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如植物樣品制備、提取 DNA 的緩沖液選擇、標(biāo)準(zhǔn)品選擇和流式細(xì)胞檢測(cè)方法等方面進(jìn)行歸納，總結(jié)出了植物細(xì)胞核 DNA 流式檢測(cè)的方法和技巧，可為植物科學(xué)研究者和從事流式細(xì)胞儀操作的技術(shù)人員提供參考。
1 植物細(xì)胞核 DNA 制備
1. 1 植物材料選擇
測(cè)試前對(duì)植物材料進(jìn)行選擇和樣本制備是關(guān)系到流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞核 DNA 成功與否的關(guān)鍵，若檢測(cè)中樣本出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片則會(huì)遮掩細(xì)胞核 DNA 信息，影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本細(xì)胞核的成峰效果和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般植物取材需要考慮樣品易獲性、細(xì)胞核型的穩(wěn)定性和保存性等一系列問(wèn)題。植物樣品最好選取新鮮的葉片或者幼嫩葉片，因其較易獲得合適的單細(xì)胞懸液，但也有研究者選取植物的根、莖等其它部位。例如，Dolezel 等[3]利用植物根尖分生組織制備染色體細(xì)胞懸液，對(duì)植物組織和細(xì)胞進(jìn)行了 DNA 含量、倍性研究; Saito 等[5]利用流式細(xì)胞儀對(duì)萱草屬植物物種和栽培品種的葉、根、根狀莖、花梗進(jìn)行了倍性分析，發(fā)現(xiàn)葉基部組織是最合適的材料。在野外采集中由于受條件限制，研究者經(jīng)常采用濕濾紙包裹植物樣本并裝入密封塑料袋中置于冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后再置于-70℃冰箱中保鮮; 還有使用自然風(fēng)干和快速干燥等方法保存樣品的。Suda 等[6]對(duì)新鮮、凍存、干燥的維管束植物樣本進(jìn)行了流式細(xì)胞核 DNA 含量測(cè)定可行性的比較研究，發(fā)現(xiàn)利用維管束植物快速脫水干燥方法保存的樣品進(jìn)行流式細(xì)胞核 DNA 測(cè)定是可行的，這使那些難以得到新鮮材料的稀有物種或不便及時(shí)處理的樣品也能夠利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)成為了現(xiàn)實(shí)，促進(jìn)了植物系統(tǒng)學(xué)、生態(tài)學(xué)和種群生物學(xué)的研究和發(fā)展。
1. 2 DNA 核解離液的選擇
流式細(xì)胞儀要求被檢測(cè)的植物樣本必須是完整的單細(xì)胞或細(xì)胞核懸液。在制備植物單細(xì)胞懸液時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的碎片，干擾細(xì)胞核 DNA 含量的檢測(cè)。目前還未發(fā)現(xiàn)能適合于所有物種的通用解離液。Loureiro 等[7]以蘆葦作為材料比較了 4 種解離液( Galbraith's /LB01 /OTTO/Tris·MgCl2 ) 的測(cè) 試效果，發(fā)現(xiàn) LB01 和 OTTO 解離液的效果最好，且 OTTO 對(duì)一些 DNA 含量較低的物種也能得到較好結(jié)果。根據(jù)不同植物的組成特性，選擇合適的植物細(xì)胞核解離液將有助于細(xì)胞核的完全游離。如一些植物( 臭椿、擬南芥、獼猴桃等) 體內(nèi)含有較高濃度的淀粉、多糖、磷酸鈣等新陳代謝類(lèi)的黏性物質(zhì)，為了消除酚類(lèi)黏性物質(zhì)的影響，在提取細(xì)胞核懸液時(shí)需加入體積濃度為 1%的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP) 。Li 等[8]采用 Hepes 緩沖液分析發(fā)現(xiàn)了迄今為止最高倍性( 10 倍體) 的獼猴桃。Chen 等[9]采用 WPB 緩沖液分析得到枸杞物種基因組的大小，枸杞果實(shí)含有許多胞漿化合物( 如酚酸類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物) ，會(huì)干擾細(xì)胞核 DNA 熒光染色，加入偏亞硫酸氫鈉和黏合劑 PVP-10 可以防止酚和次級(jí)代謝產(chǎn)物等的干擾。筆者參考國(guó)外文獻(xiàn)[10，11]并結(jié)合對(duì)來(lái)自深圳市仙湖植物園 120 份蕨類(lèi)和苔蘚植物樣本的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LB01 解離液比其它種類(lèi)解離液更適合該類(lèi)植物的細(xì)胞核裂解。表 1 中列出了實(shí)驗(yàn)中常用的 8 種植物細(xì)胞核解離液及其配方，以供大家參考。
1. 3 參照樣本的選擇原則
流式細(xì)胞儀可以通過(guò)內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)法進(jìn)行細(xì)胞核 DNA 含量測(cè)定。常規(guī)的倍性分析多采用外標(biāo)法，而更精確的倍性分析建議采用內(nèi)標(biāo)法，如檢測(cè)異倍體。內(nèi)標(biāo)法可參照樣本已知的染色體倍性，推算測(cè)試樣品細(xì)胞核 DNA 的絕對(duì)含量，以避免因待測(cè)樣品的變異和機(jī)器工作狀態(tài)不穩(wěn)定帶來(lái)的誤差。內(nèi)標(biāo)法的參照樣本應(yīng)滿足以下條件: 參照樣本細(xì)胞核 DNA 含量已知且穩(wěn)定，同目標(biāo)樣本細(xì)胞核 DNA 含量相近; 參照樣本與目標(biāo)樣本的基因組大小范圍相近; 標(biāo)準(zhǔn)樣本峰不能同目標(biāo)樣本峰重疊，最好與目標(biāo)樣本的 G2 或 M 期峰值不重疊。
目前在植物細(xì)胞核 DNA 含量的研究中仍采用雞血紅細(xì)胞用作植物材料的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，雞血紅細(xì)胞來(lái)源多，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。如 Roux 等[12]以雞血紅細(xì)胞作為內(nèi)參對(duì)照，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了香蕉細(xì)胞核 DNA 含量和染色體數(shù)目; Phivnil 等[13]用已知的大麥品種細(xì)胞核 DNA 含量作為對(duì)照鑒定了多個(gè)獼猴桃品種的倍性。常用參照樣本的倍性和細(xì)胞核 DNA 含量可見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14，15]。
1. 4 熒光核酸染料的選擇
不同熒光探針的選擇對(duì)檢測(cè)植物細(xì)胞核 DNA 含量至關(guān)重要，細(xì)胞核染料主要分 2 種，特異標(biāo)記和非特異標(biāo)記染料。特異標(biāo)記 DNA 熒光染料是非嵌入染色，主要與 DNA 的 A-T 堿基結(jié)合，忽略了 DNA 還有很多 G-C 堿基，會(huì)造成檢測(cè)基因組值偏小。因此最常用是非特異染料( 如 PI) ，但此方法操作時(shí)會(huì)使 DNA 和 RNA 也同時(shí)被染上色，需要降解 RNA 的干擾。現(xiàn)將流式細(xì)胞儀常用熒光核酸染料及其檢測(cè)波長(zhǎng)和特性列于表 2。
1. 5 植物樣本優(yōu)化
制備好的植物樣品最好采用過(guò)濾方法和離心方法進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和黏連細(xì)胞，這非常有利于流 式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)和成峰效果。Lee等[16]通過(guò)比較 PVP 設(shè)計(jì)的棉花濾管過(guò)濾法與尼龍網(wǎng)過(guò)濾法對(duì)提取液的過(guò)濾效果，結(jié)果顯示用棉花濾管過(guò)濾的提取液能夠去除多醣體，效果優(yōu)于尼龍網(wǎng); 于紅梅等[17]利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)草莓染色體倍性時(shí)，以匍匐莖尖或根尖的細(xì)胞為材料，在常規(guī)提取液中添加巰基乙醇，采用細(xì)胞核 DNA 懸浮液離心漂洗 3 次后再經(jīng) 300 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾的方法，得到了理想的結(jié)果。裸子植物有較厚的角質(zhì)層，細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)多，需要較長(zhǎng)時(shí)間解離細(xì)胞核 DNA，比被子植物更難制備出完整的細(xì)胞核懸浮液。因此，制備的新鮮樣品如果當(dāng)天檢測(cè)細(xì)胞核 DNA 的信號(hào)不佳，可將樣品放置冰箱避光 1～ 2 d 后再上機(jī)檢測(cè)，效果也許會(huì)更好。
2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物樣本
2. 1 建立流式檢測(cè)的方案
植物種類(lèi)繁多，染色體倍性復(fù)雜、多樣。植物細(xì)胞普遍存在內(nèi)復(fù)制現(xiàn)象，往往以多倍體的形式存在，造成細(xì)胞核 DNA 含量的變化范圍較大，從 2C 到 16C，甚至到 128C，因此對(duì)這類(lèi)植物多倍體宜采用動(dòng)態(tài)范圍寬的對(duì)數(shù)形式。有些情況下植物細(xì)胞核 DNA 倍性變化范圍很窄，可以參照動(dòng)物和人細(xì)胞動(dòng)態(tài)范圍小的線性關(guān)系，則能更清楚地顯示不同物種間的變化。
本文來(lái)源于：《植物科學(xué)學(xué)報(bào)》Plant Science Journal(雙月刊)本刊主要刊載植物學(xué)及各分支學(xué)科的原始研究論文，植物學(xué)研究的新技術(shù)、新方法，綜合評(píng)述(應(yīng)結(jié)合作者本人的研究工作、反映本學(xué)科在國(guó)內(nèi)外的最新研究進(jìn)展)、研究簡(jiǎn)報(bào)、學(xué)術(shù)討論、重要書(shū)刊評(píng)介和學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)等。
植物物種眾多，細(xì)胞大小差異較大，有些植物細(xì)胞較小，容易與碎片混淆。實(shí)際操作中，如果流式細(xì)胞儀的 FSC 閾值調(diào)得太高，細(xì)胞與碎片會(huì)被一起去掉，反之細(xì)胞與碎片則無(wú)法分開(kāi)。我們的經(jīng)驗(yàn)是，首先根據(jù)植物細(xì)胞大小，確定植物細(xì)胞群位置，排除其它雜質(zhì)、背景噪音的干擾，即確定合適前向散射光( FSC) 閾值; 其次是去除黏連細(xì)胞，其目的是避免假陽(yáng)性結(jié)果，保證多倍體細(xì)胞與黏連細(xì)胞不被混淆。流式細(xì)胞儀去除黏連細(xì)胞的方案有許多，常規(guī)方法是根據(jù)細(xì)胞面積和寬度來(lái)設(shè)計(jì)去除黏連細(xì)胞。然而，在實(shí)際應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)一些樣品的檢測(cè)效果不好，可換成采用側(cè)向散射光( SSC) 和 PI 熒光染料的通道去除黏連細(xì)胞以獲得較理想的結(jié)果，這主要是 SSC 參數(shù)能夠更好地反映細(xì)胞核聚集。因此，建立最佳流式細(xì)胞儀檢測(cè)方案、調(diào)節(jié)合適電壓也是流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物細(xì)胞核 DNA 含量的關(guān)鍵步驟。
2. 2 應(yīng)用實(shí)例
流式細(xì)胞術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、高通量檢測(cè)植物倍性水平、種內(nèi)雜交、單性生殖，以及基因組的大小、多倍體和性染色體的方法。Cousin 等[18]在 6 h 內(nèi)對(duì) 192 例蕓苔屬植 物 采 用 96 孔 板 BeadBeating 制備方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行了細(xì)胞核 DNA 含量測(cè)定，摸索出大規(guī)模高通量檢測(cè)的方法，且保證了數(shù)據(jù)和樣品的可重復(fù)性，是非常值得借鑒的一種制備植物樣品的方法。Dolezel 等[19]通過(guò)比較 4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同的操作人員、不同方法、不同儀器估計(jì)細(xì)胞核 DNA 基因組的大小，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)室間差異較小; 使用 Galbraith buffer 和 PI 能夠測(cè)定大多數(shù)植物種類(lèi)的絕對(duì)基因組大小，PI 比 DAPI 更可靠、更適合用于評(píng)估植物基因組的大小; 當(dāng)基因組差異較小時(shí)，應(yīng)該在同一實(shí)驗(yàn)室使用相同的儀器來(lái)消除系統(tǒng)性誤差。在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)制備植物細(xì)胞核 DNA 樣本最關(guān)鍵的是選擇合適的細(xì)胞核解離液。采用煙草和油菜為材料對(duì) 8 種 DNA 緩沖液進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn) Hepes 緩沖液適合于大多數(shù)植物，變異系數(shù)最小; 其次是 Tris· MgCl2和 LB01( 圖 1) 。對(duì)于倍性相對(duì)復(fù)雜的植物，因倍性越高，變異系數(shù)也越大，應(yīng)選擇與之相近的物種標(biāo)準(zhǔn)品作內(nèi)參，以避免或減小誤差。筆者在此將本實(shí)驗(yàn)室近期使用流式細(xì)胞儀( BD 公司，AriaⅢ 型) 檢測(cè)植物細(xì)胞核 DNA 含量樣本的使用方法歸納列于表 3，供大家參考。
總之，針對(duì)不同植物種類(lèi)需要根據(jù)物種特性采用不同的制備細(xì)胞核 DNA 方法。我們也將在今后的實(shí)驗(yàn)中不斷地探索，以期總結(jié)出更好的方法。——論文作者：汪 艷* ，肖 媛，劉 偉，李婷婷，胡 銳，喬志仙
參考文獻(xiàn):
[1] 焦旭雯，趙樹(shù)進(jìn). 流式細(xì)胞術(shù)在高等植物研究中的應(yīng)用[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2006，14 ( 4) : 354-358.
[2] Galbraith DW，Lambert GM，Macas J，Dolezel J. Analysis of nuclear DNA content and ploidy in higher plants[J]. Curr Protoc Cytom，2001，7 ( 6) : 1-22.
[3] Dolezel J，Bartos J. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size[J]. Ann Bot， 2005，95( 1) : 99-110.
[4] Hare EE，Johnston JS. Genome size determination using flow cytometry of propidium iodide-stained nuclei[J]. Methods Mol Biol，2011，772: 3-12.
[5] Satio H，Mizunashi K，Tanaka S，Adachi Y，Nakano M. Ploidy estimation in Hemerocallis species and cultivars by flow cytometry[J]. Scientia Horticulturae，2003，97: 185-192.
[6] Suda J，Trávnicek P. Reliable DNA Ploidy determination in dehydrated tissues of vascular plants by DAPI flow cytometry———new prospectsfor plant research[J]. Cytometry A，2006，69( 4) : 273-280.
[7] Loureiro J，Rodriguez E，Dolezel J，Santos C. Comparison of four nuclear isolation buffers for plant DNA flow cytometry[J]. Ann Bot，2006，98 ( 3) : 679-689.
[8] Li ZZ，Man YP，Lan XY，Wang YC. Ploidy and phenotype variation of a natural Actnidia arguta population in the east of Daba Mountain located in a region of Shaanxi[J]. Scientia Horticulturae， 2013，161: 259-265.
[9] Chen JJ，Liu XL，Zhu LY，Wang Y. Nuclear genome size estimation and karyotype analysis of Lycium species[J]. Scientia Horticulturae，2013， 151: 46-50.