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摘 要： 摘 要: 從馬齒莧植株中分離內生真菌，提取其代謝產物，以黃酮類化合物顯色反應和紫外光譜特征對內生真菌代謝產物進行初步鑒定，篩選得到產黃酮內生真菌 AG -10，使用 ITS1、ITS4 通用引物，擴增菌株 AG-10 的 18S rDNA 序列，結合菌落和分生孢子形態(tài)特征，對菌株 AG-10
摘 要: 從馬齒莧植株中分離內生真菌，提取其代謝產物，以黃酮類化合物顯色反應和紫外光譜特征對內生真菌代謝產物進行初步鑒定，篩選得到產黃酮內生真菌 AG -10，使用 ITS1、ITS4 通用引物，擴增菌株 AG-10 的 18S rDNA 序列，結合菌落和分生孢子形態(tài)特征，對菌株 AG-10 進行分類鑒定，并采用濾紙片法研究 AG-10 的代謝產物抑菌效果; 菌株 AG-10 鑒定結果為鐮刀菌( Fusarium sp.) ，其代謝產物可抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，最小抑菌質量濃度分別為 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL。研究結果證實了馬齒莧中存在有可能產黃酮類化合物的內生真菌，為利用微生物產黃酮類化合物提供參考。
關鍵詞: 馬齒莧; 內生真菌; 黃酮; 抑菌
0 引 言
植物內生菌( Endophyte) 是指能夠生活在植物各組織和器官內，而不引起植物病變的一類微生物，可分為真菌、細菌和放線菌三大類[1]，自 1993 年 A. Stierle 等[2]人從紅豆杉中分離得到一株能夠產紫杉醇的 Taxomyces andreanae 的真菌后，為植物內生真菌生產天然活性物質提供了理論基礎。植物的生長各階段、藥用成分都與內生菌尤其是內生真菌[3]相關，植物內生真菌的主要代謝產物為糖類、苯丙素類、醌類、黃酮類、萜類、甾體和生物堿等類群[4]，其中黃酮類化合物因具有抗 炎、抗菌和抗病毒等作用而受到 普遍關注[5-6]。馬齒莧( Portulaca oleracea L.) 為常見草本植物，主要生物活性成分: 黃酮類、生物堿、多糖類、兒茶酚、三萜類，具有抗菌、抗氧化作用、抗病毒等作用[7-10]，目前主要集中在對馬齒莧代謝產物的研究，但對產黃酮馬齒莧內生真菌代謝產物的研究仍比較少。
本研究從馬齒莧中分離出內生真菌，以黃酮類化合物顯色反應和紫外光譜特征對內生真菌代謝產物初步鑒定，篩選出產黃酮的內生真菌，擴增其 18S rDNA 序列，并結合菌落和分生孢子的形態(tài)特征，對菌株進行鑒定，并采用濾紙片法，測試其代謝產物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，探究其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌濃度。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗所用野生馬齒莧采自于陜西省延安市棗園鎮(zhèn)( N36°37'22. 11″，E109°25'44. 09″) ，用無菌采樣袋避光運回實驗室，材料需當天開展試驗使用。
1.1.1 指示菌株
試驗所用金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、大腸桿菌( Escherichia coli) 由延安大學資源與環(huán)境微生物實驗室提供。
1.1.2 主要儀器
GR110DA 滅 菌 器 ( 廈 門 致 微 儀 器 有 限 公司) ，UV-1780 紫外可見光分光光度計( 日本島津) ，T960 型 PCR 儀( 力康生物科技有限公司) ， RE-5298 旋轉蒸發(fā)儀( 上海昕儀儀器儀表有限公司) 。
1.1.3 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 ( potato dextrose agar，PDA) : 馬鈴薯 200. 0 g，葡萄糖 20. 0 g，蒸餾水 1 000. 0 mL，pH 自然，121 ℃滅菌 20 min，配制固體培養(yǎng)基時，則需另加入 15. 0～20. 0 g 瓊脂粉。
PYG 培養(yǎng)基( peptone yeast glucose broth) : 牛肉膏 3. 0 g，蛋白胨 5. 0 g，酵母膏 0. 2 g，葡萄糖 5. 0 g，NaCl: 0. 5 g，MgSO4·7H2O: 1. 5 g，蒸餾水 1 000. 0 mL，pH 7. 2 ～ 7. 5，121 ℃ 滅菌 20 min，配制固體培養(yǎng)基時，則需另加入 15. 0～20. 0 g 瓊脂粉。
水瓊 脂 培 養(yǎng) 基: 瓊 脂 粉 17. 0 g，蒸 餾 水 1 000. 0 mL，121 ℃滅菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 樣品的表面消毒
將采集馬齒莧的根和莖用無菌水進行多次沖洗，去除表面塵土，待表面干燥，進行表面消毒處理，莖使用體積分數為 75%乙醇溶液消毒 40 s，然后再使用體積分數為 3% 次氯酸鈉溶液消毒 4 min，根使用體積分數為 75%乙醇溶液消毒 30 s、然后再使用體積分數為 3%次氯酸鈉溶液消毒 2 min。樣品表面消毒完全后，備用。
1.2.2 內生真菌的分離、純化
用無菌水沖洗消毒完全的莖和根 3 次，最后一次沖洗植物組織的無菌水用移液槍吸取 30. 0 μL移入 PYG、PDA 平板中，用涂布器涂抹均勻，以此作為對照組。將消毒完全的莖和根與滅菌石英砂一起研磨，加入 10. 0 mL 的無菌水制成懸液，依次進行梯度稀釋，稀釋倍數分別為: 10、102 、103 、 104 、105 、106 ，將稀釋好的懸液 30. 0 μL 分別涂布在 PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng) 5 d，每個梯度設置 3 個平行對照，以氣生菌絲和營養(yǎng)菌絲的形態(tài)、長度和顏色為分類依據，挑取菌絲，轉接到新的 PDA 固體培養(yǎng)基上，進行菌種純化，菌株編號依次為: AG-1、AG-2、AG-3、……AG-n。
1.2.3 內生菌代謝產物提取
將所分 離 純 化 的 馬 齒 莧 內 生 真 菌 接 種 至 PDA 液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，28 ℃，160 r/min，發(fā)酵7 d，發(fā)酵液體積為 2. 0 L，待發(fā)酵完畢，四層紗布過濾發(fā)酵液，除去菌絲，將濾液 100 ℃ 水浴加熱，濃縮至 50. 0 mL，濃縮液先用 50. 0 mL 石油醚除去脂質等雜質，然后再用乙酸乙酯分 3 次萃取濃縮液中馬齒莧內生真菌代謝產物，濃縮液與萃取劑的體積比始終保持 1 ∶ 1，合并 3 次萃取劑，65 ℃ 旋轉蒸發(fā)乙酸乙酯，蒸發(fā)至近干后用 20. 0 mL 甲醇溶解固體物質，過 0. 45 μm 有機系濾膜，揮干甲醇備用[11]。
1.2.4 產黃酮內生真菌篩選
參考《天然藥物化學( 第 6 版) 》中黃酮類化合物顯色反應[12]，對所提取的內生真菌代謝產物進行顯色反應，所選擇的黃酮類化合物顯色反應為: 硝酸鋁-亞硝酸鈉反應、鹽酸鋅粉反應、三氯化鐵反應、氫氧化鈉反應、乙酸鎂反應。并對符合黃酮類化合物顯色反應的菌株代謝產物進行紫外光譜掃描[13]，紫外光譜用甲醇作為參比溶液，建立基線，檢測波長為 200 nm～800 nm，掃描速度為高速，狹縫寬設置為 2. 0，獲得光譜。符合黃酮類化合物顯色反應和紫外光譜圖特征的菌株代謝產物，可認為該菌株能夠產黃酮，上述反應中以蘆丁為陽性對照，以無菌水為陰性對照。
1.2.5 產黃酮內生真菌鑒定
采用光學顯微鏡對產黃酮內生真菌進行形態(tài)觀察，首先，將內生真菌接種在水瓊脂培養(yǎng)基上，將無菌蓋玻片傾斜插入菌落四周，28 ℃，培養(yǎng) 4 d，待到菌絲生長至蓋玻片上時，取出蓋玻片，滴加棉蘭染液染色在顯微鏡下觀察，產孢結構等特征對照《普通真菌學》、《半知菌分屬圖冊》進行初步形態(tài)學分類鑒定[14-15]。
使用 ITS1、ITS4 引物，擴增菌株 18S rDNA 序列進行分子生物學鑒定，總 DNA 提取使用索萊寶公司生產的真菌基因組 DNA 提取試劑盒( Fungi Genomic DNA Extraction Kit) ，擴增 18S rDNA 序列所使用的引物為 ITS1( 5'-CTTCGTCATTAGAGAAGTAA-3') ，ITS4 ( 5-TCCTCCGCTTAGATATGC-3 ) ， PCR( polymerase chain reaction) 反應體系和條件參照康為世紀生產 2×Taq MasterMix( Dye) 所提供的反應體系和條件，94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性 40 s，55 ℃ 退火 40 s; 72 ℃ 延伸 50 s，35 個循環(huán)， 72 ℃終延伸 10 min，4 ℃低溫保存。
PCR 擴增產物用 1%瓊脂糖凝膠，90 V 水平電泳 30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢查擴增結果。擴增產物送至上海生工進行測序，測序結果在 NCBI( national center for biotechnology information) 數據庫進行 BLAST 比對，使用軟件 MEGA-X 構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并將測序結果上傳至 GenBank，申請菌株序列登錄號。
1.2.6 產黃酮內生真菌代謝產物抑菌活性測定
采用濾紙片法對產黃酮內生真菌代謝產物抑菌活性測試，待測內生真菌代謝產物 1. 0 g，溶于 100. 0 mL 水中，此時質量濃度為 10. 0 mg /mL，并稀釋成質量濃度為 0. 5 mg /mL、1 mg /mL、2 mg /mL、5 mg /mL 的溶液備用。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌用無菌水配制成 OD600 = 1. 00 的指示菌菌 懸 液，30 μL 涂 布 在 PYG ( peptone yeast glucose broth) 固體培養(yǎng)基上，將浸潤在各個濃度代謝產物溶液中的濾紙片放在涂布過指示菌的 PYG 固體培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng) 4 d，測量抑菌圈直徑。每組實驗設置 3 個平行對照，以無菌水為空白對照，指示菌為金黃色葡萄球菌，為革蘭氏陽性菌，故陽性藥物 1 選用青霉素; 大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，故陽性藥物 2 選用頭孢唑林鈉。選用等濃度的青霉素和頭孢唑林鈉作為陽性對照。
2 結 果
2.1 產黃酮內生真菌篩選
2.1.1 內生菌代謝產物顯色反應
使用 PDA 固體培養(yǎng)基從馬齒莧根和莖中分離得到 5 株代謝產物與黃酮顯色反應相似的菌株，如表 1 所示。其中菌株 AG-10 和 AG-7 硝酸鋁-亞硝酸鈉反應為陽性，菌株 AG-10 在所進行的顯色試驗中均呈陽性，初步鑒定菌株 AG-10 代謝產物為黃酮類化合物。
2.1.2 內生真菌代謝產物紫外光譜檢測
黃酮類化合物的甲醇溶液普遍在 200 nm ～ 400 nm 會出現兩個峰帶，即 300 nm～400 nm 峰帶 Ⅰ和 220 nm～280 nm 峰帶Ⅱ[12]，以黃酮類代表物質蘆丁紫外光譜圖為對照，對菌株 AG-10 代謝產物進行紫外光譜分析，結果如圖 1 所示，菌株 AG10 在 376. 0 nm 處 有 弱 吸 收 峰，在 269. 0 nm、 219. 0 nm、207. 0 nm 處有 3 個明顯的吸收峰，蘆丁在 357. 6 nm、256. 6 nm、206. 0 nm 處有 3 個明顯吸收峰，蘆丁和菌株 AG-10 代謝產物均在 300 nm～400 nm 和 220 nm～280 nm 出現吸收峰，這與黃酮類化合物吸收峰特征相符，結合顯色試驗反應結果，進一步說明菌株 AG-10 代謝產物中含有黃酮類物質。
2.2 菌株鑒定
AG-10 菌絲前期呈白色，后期呈淺黃色，菌絲稀疏平鋪較長，菌落背面為淺黃棕色，菌落中間厚邊緣略薄，分生孢子梗細長，分支，孢子鐮刀形，無色; 18S rDNA 序列 PCR 擴增產物大小為 550 bp，測序結果在 NCBI 數據庫進行 BLAST 比對，結果顯示 AG-10 與 Fusarium oxysporum ( JX045827 ) 18S rDNA 序列相似性為 99%，選擇 18S rDNA 序列相似性大于 99%的菌株序列，使用 MEGA-X 軟件，采用 N-j 法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結合菌株的形態(tài)特征和 18S rDNA 序列，初步鑒定 AG-10 為鐮 孢 霉 ( Fusarium sp.) ，測序結果上傳至 GenBank 申請序列登錄號: MK951708。
2.3 內生真菌代謝產物抑菌活性測定
參考抑菌圈實驗標準: 抑菌圈直徑> 20 mm 屬于極敏感，15 ～ 20 mm 屬于高敏感，10 ～ 15 mm 屬于中敏感，7～ 9 mm 屬于低敏感，抑菌圈直徑< 7 mm屬于不敏感[16]。
AG-10 內生菌代謝產物抑菌活性結果如表 2、表 3 所示，代謝產物抑菌效果隨著代謝產物濃度的增加而增加。代謝產物質量濃度為1. 0 mg /mL 時，對金黃色葡萄球菌有抑制作用，但效果不明顯，對大腸桿菌無抑菌作用; 代謝產物質量濃度為 2. 0 mg /mL時，對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈直徑在 4～6 mm 范圍內，屬于不敏感，對大腸桿菌有抑菌作用，但效果不明顯; 代謝產物質量濃度為 5. 0 mg /mL 時，對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，抑菌圈直徑在 10 ～ 13 mm 范圍內，屬于中敏感，對大腸桿菌有抑菌作用，抑菌圈直徑在 7 ～ 9 mm 范圍內，屬于低敏感; 代謝產物質量濃度為 10. 0 mg /mL 時，對金黃色葡萄球菌有十分明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑在 17～19 mm 范圍內，屬于高敏感，對大腸桿菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑在 12～ 14 mm 范圍內，屬于中敏感。AG-10 代謝產物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃度為 1. 0 mg /mL，對大腸桿菌的最小抑菌質量濃度為 2. 0 mg /mL。
3 討 論
據現有報道，趙慶云等[17]利用 HLPC-UV 技術從銀杏中分離、篩選出 7 株產黃酮內生真菌，結合內生真菌菌絲形態(tài)和孢子特征，鑒定為匐柄霉、叢梗孢屬、交鏈孢屬、鐮孢霉屬、赤霉屬、蜜孢霉、和暗梗單孢霉屬。張海龍等[18]通過顯色反應、薄層層析( thin layer chromatography，TLC) 、高效液相色譜法( high-performance liquid chromatograhy， HPLC) 從銀杏中分離得到兩株產黃酮內生真菌，卷枝毛霉和尖鐮孢霉。騰艾靜等[13]對苣荬菜中黃酮類化合物的抑菌活性進行了研究，結果顯示，苣荬菜中黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，最小抑菌質量濃度為 0. 5 mg /mL。
本研究從馬齒莧根內篩選出一株產黃酮內生真菌 AG-10，通過形態(tài)學特征，結合 18S rDNA 序列，鑒定為鐮孢霉菌。AG-10 代謝產物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌作用，最小抑菌質量濃度分別為 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL，且抑菌活性與濃度存在一定的量效關系，隨濃度增加，抑菌活性也呈正比例關系逐漸增加。AG-10 代謝產物的抑菌活性與等濃度的青霉素與頭孢唑林鈉相比效果較弱，可能是由于未對 AG-10 代謝產物進行純化，代謝產物成分較為復雜。下一步可對 AG-10 代謝產物進行分離、純化，以期獲得高純度的抑菌活性物質。
馬齒莧中黃酮的藥理學研究已逐漸成為一個研究的熱點，有研究表明，馬齒莧中的黃酮類化合物具有抗菌消炎、降脂等多種作用，本研究中 AG10 黃酮類代謝產物與馬齒莧植源型黃酮類化合物是否具有一定的內在聯(lián)系，還有待研究。下一步應對 AG-10 菌株進行生理特性研究和菌體內黃酮代謝途徑的研究。在初步分離的內生真菌中，AG-4、AG-5、AG-7 和 AG-9 四株菌代謝產物黃酮類顯色反應中有一種或幾種微弱的陽性反應，有可能是發(fā)酵液中黃酮含量較低，代謝產物化學結構過于復雜，從而影響顯色反應結果，因此下一步研究應采取高效液相( HPLC) 、質譜( mass spectrometry，MS) 、核 磁 共 振 ( nuclear magnetic resonance，NMR) 等方法[19]，對代謝產物的化學結構進一步分析，將產黃酮類真菌的代謝產物一一分離，得到單體化合物。并通過發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化等方法和手段，提高代謝產物的產量，使利用微生物發(fā)酵生產黃酮類物質成為可能。
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4 結 論
本研究從馬齒莧中分離內生真菌，以黃酮類化合物顯色反應和紫外光譜特征對內生真菌代謝產物進行初步鑒定，篩選出產黃酮內生真菌 AG10，經鑒定 AG-10 鐮孢霉，其代謝產物可抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，最小抑菌質量濃度分別為 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL。——論文作者：艾加敏，余天飛，李 靜，姜影影，柳曉東，鄧振山*
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