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摘 要： 摘要背景：許多研究證實了生物材料的物理性質(zhì)尤其是其硬度能夠調(diào)控干細(xì)胞向目的細(xì)胞定向分化。目的：綜述細(xì)胞外基質(zhì)對干細(xì)胞行為的影響及生物材料物理性質(zhì)調(diào)控干細(xì)胞分化的最新研究進(jìn)展。方法：由第一作者檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫和 Web of Science 數(shù)據(jù)庫，檢索詞分別
摘要背景：許多研究證實了生物材料的物理性質(zhì)尤其是其硬度能夠調(diào)控干細(xì)胞向目的細(xì)胞定向分化。目的：綜述細(xì)胞外基質(zhì)對干細(xì)胞行為的影響及生物材料物理性質(zhì)調(diào)控干細(xì)胞分化的最新研究進(jìn)展。方法：由第一作者檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫和 Web of Science 數(shù)據(jù)庫，檢索詞分別為 “細(xì)胞外基質(zhì)、生物支架材料、化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)、基質(zhì)硬度、干細(xì)胞分化”和“extracellular matrix, biomaterials scaffolds, chemical properties, physical properties, substrate rigidity, stem cell differentiation”。語言分別設(shè)定為中文和英文，最終選擇 31 篇文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論：生物材料支架的物理性質(zhì)能夠影響細(xì)胞的增殖、遷移和分化等行為，尤其是硬度調(diào)控干細(xì)胞分化對組織工程及再生醫(yī)學(xué)都具有極大的啟示。尋找更多與細(xì)胞外基質(zhì)硬度共同作用的生物化學(xué)因素和物理因素，精確控制細(xì)胞行為，制備出與體內(nèi)生理環(huán)境更加相似的支架材料值得深入研究和探討。
關(guān)鍵詞：干細(xì)胞;材料相容性;細(xì)胞外基質(zhì);組織工程;生物材料;復(fù)合材料;物理性質(zhì);基底硬度;定向分化
0 引言 Introduction
干細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的固有性質(zhì)非常敏感，基質(zhì)彈性誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的重要性已經(jīng)成為一種新型的敏感性非常高的細(xì)胞調(diào)節(jié)因素。模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)設(shè)計的生物材料，不僅為細(xì)胞和再生組織提供一個暫時的結(jié)構(gòu)支持，同時也能通過傳導(dǎo)必要的生物物理、生物力學(xué)和生物化學(xué)信號來調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、增殖、分化以及組織結(jié)構(gòu)的形成。細(xì)胞外基質(zhì)的物理性質(zhì)，特別是硬度或彈性，能對細(xì)胞的黏附、鋪展、增殖、遷移和分化等多種功能和行為產(chǎn)生重要影響。研究基質(zhì)表面彈性對蛋白吸附及干細(xì)胞分化和分泌功能的作用，是組織工程用生物材料設(shè)計的一個新思路。文章論述了生物材料物理性質(zhì)對干細(xì)胞分化的影響以及模擬細(xì)胞外基質(zhì)物理性質(zhì)調(diào)控干細(xì)胞分化行為的最新研究進(jìn)展，對未來需要重點研究的問題進(jìn)行了展望。
1 資料和方法 Data and methods
1.1 文獻(xiàn)檢索和篩選要求
1.1.1 檢索數(shù)據(jù)庫 中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI);Web of Science數(shù)據(jù)庫。
1.1.2 檢索數(shù)據(jù)庫的選擇理由 Web of Science數(shù)據(jù)庫和中國期刊全文數(shù)據(jù)庫分別是國外和國內(nèi)最權(quán)威的生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)多且全面。
1.1.3 檢索途徑、檢索詞及各檢索詞的邏輯關(guān)系 為全面、準(zhǔn)確地檢索出撰寫該綜述的相關(guān)文獻(xiàn)，文章寫作過程中綜合考慮了檢索途徑的選擇、檢索詞的選擇和各檢索詞間邏輯關(guān)系的配置，制定了科學(xué)的檢索策略。
檢索途徑：關(guān)鍵詞檢索、摘要檢索、全文檢索。
檢索詞：中文檢索詞為“細(xì)胞外基質(zhì)、生物支架材料、化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)、基質(zhì)硬度、干細(xì)胞分化”。英文檢索詞為“ extracellular matrix, biomaterials scaffolds, chemical properties, physical properties, substrate rigidity, stem cell differentiation”。
檢索詞的邏輯組配：先以“細(xì)胞外基質(zhì)”AND“支架材料”進(jìn)行檢索，然后分別將物理性質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)，基質(zhì)硬度與干細(xì)胞分化匹配進(jìn)行檢索。
1.2 文獻(xiàn)篩選流程和篩選標(biāo)準(zhǔn)
1.2.1 文獻(xiàn)篩選流程 按照圖1的步驟進(jìn)行。
1.2.2 文獻(xiàn)的篩選標(biāo)準(zhǔn) ①仿生材料的設(shè)計研究;②生物材料的物理化學(xué)性質(zhì)對干細(xì)胞行為影響的相關(guān)研究。
1.2.3 文獻(xiàn)的排除標(biāo)準(zhǔn) ①相似的陳舊的文獻(xiàn);②與此文研究目的不相關(guān)文章。
1.2.4 篩選偏離的描述、原因及對結(jié)果的影響 該綜述所有納入文章均經(jīng)組內(nèi)討論，以避免存在篩選偏離。
1.2.5 文獻(xiàn)篩選結(jié)果的輸出形式 文獻(xiàn)檢索和篩選結(jié)果的輸出采用文獻(xiàn)的引用形式，且保持了格式的一致性，文獻(xiàn)的引用形式包括作者、題名、期刊名稱、發(fā)表年代、卷數(shù)(期數(shù))、頁碼等。經(jīng)篩選納入評價的文獻(xiàn)提供了全文。
2 結(jié)果 Results
2.1 細(xì)胞外基質(zhì)對細(xì)胞行為的影響 細(xì)胞外基質(zhì)是由動物細(xì)胞合成并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間 的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。細(xì)胞外基質(zhì)不僅具有連接、支持、保水、抗壓及保護(hù)等物理學(xué)作用，而且對細(xì)胞的基本生命活動發(fā)揮著全方位的生物學(xué)作用，如支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動等。細(xì)胞和細(xì)胞之間，細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用以及溫度、營養(yǎng)、細(xì)胞因子等共同構(gòu)成的組織環(huán)境稱為微環(huán)境。干細(xì)胞的微環(huán)境又稱為干細(xì)胞 Niche(干細(xì)胞壁龕) [1]，其在干細(xì)胞生長和功能的維持和調(diào)節(jié)中起到重要的作用。微環(huán)境對細(xì)胞增殖分化的影響主要有3個方面：①細(xì)胞與細(xì)胞的相互影響;②細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的互相影響;③可溶性信號分子的影響[2]。
干細(xì)胞的命運(yùn)受控于細(xì)胞微環(huán)境中的信號分子，而細(xì)胞外基質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞微環(huán)境的重要因素之一，為細(xì)胞提供空間和機(jī)械刺激從而引導(dǎo)細(xì)胞的行為，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的物理作用調(diào)節(jié)原始細(xì)胞程序，包括分化、遷移和增殖[3]。
活細(xì)胞對環(huán)境的感應(yīng)有著許多智能系統(tǒng)的特點，一個細(xì)胞可以感覺和回應(yīng)很多化學(xué)和物理的外界信號，它可以整合和分析這些信息，從而改變自身的形態(tài)、動態(tài)行為甚至能改變最后的命運(yùn)。細(xì)胞利用細(xì)胞外基質(zhì)和臨近細(xì)胞之間構(gòu)成的信號去建立和維持它們的形狀和生理特性，這種多樣性在生物系統(tǒng)中常常與細(xì)胞的功能緊密聯(lián)系。細(xì)胞必須感應(yīng)微環(huán)境的物理性質(zhì)，并隨著時間推移適當(dāng)?shù)刈龀龌貞?yīng)，從而來取得細(xì)胞功能。當(dāng)干細(xì)胞受到細(xì)胞外基質(zhì)固有性質(zhì)(如基質(zhì)結(jié)構(gòu)、表面彈性及組成成分)的影響時，干細(xì)胞開始向成熟的組織細(xì)胞分化，這些性質(zhì)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞作用于基質(zhì)的應(yīng)力。機(jī)械敏感通道隨后把這些生物物理信息轉(zhuǎn)化成生物信號，這些生物化學(xué)信號能促進(jìn)干細(xì)胞的特異性分化。就像加入了生長因子一樣，細(xì)胞外基質(zhì)固有性質(zhì)的作用非常強(qiáng)大，它們可以在時空上控制干細(xì)胞的發(fā)育，即它們在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化及組裝時起到形態(tài)控制的作用。尤其是干細(xì)胞的命運(yùn)和種系分化緊密地依賴于細(xì)胞外基質(zhì)的彈性和表面微觀結(jié)構(gòu)。
2.2 仿生材料設(shè)計研究 組織工程研究的熱點主要集中在3個方面，即種子細(xì)胞、支架材料和生物因子。支架材料是組織工程的基礎(chǔ)，是組織工程成敗的關(guān)鍵因素，它是模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料，有利于細(xì)胞黏附、增殖乃至分化，為細(xì)胞生長提供合適的外環(huán)境。
2.2.1 對仿生材料的要求 仿生材料是為細(xì)胞組織的生長提供營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的三維多孔結(jié)構(gòu)的載體，是一種仿生的細(xì)胞外基質(zhì)，不僅要有良好的細(xì)胞相容性，提供合適的力學(xué)強(qiáng)度，而且在結(jié)構(gòu)(二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu))、生化組成和功能上都仿生。因此，選擇支架材料時除了符合一般生物醫(yī)學(xué)材料的要求外，組織工程學(xué)所需的理想支架材料應(yīng)盡可能滿足以下要求：①生物相容性和表面活性：有利于細(xì)胞的黏附，并且具有無毒，不致畸，不引起炎癥反應(yīng)等特點，為細(xì)胞的生長提供良好的微環(huán)境，能安全用于人體;②生物可降解性：在組織形成過程中逐漸降解，并且具有合適的降解速率，與組織細(xì)胞的生長速度相一致，降解時間應(yīng)能調(diào)控;③合適的表面理化性質(zhì)和較高的比表面積：有利于細(xì)胞的黏附、鋪展、遷移、增殖、分化等行為產(chǎn)生;④合適的孔徑和孔隙率[4]：這樣有利于細(xì)胞的黏附和組織的生長，促進(jìn)新生組織向材料內(nèi)部的長入，利于營養(yǎng)成分的運(yùn)輸和代謝產(chǎn)物的排出;⑤合適的機(jī)械強(qiáng)度和可塑性：為新生組織提供支撐的作用，生物材料的機(jī)械強(qiáng)度要保持一定時間直至重生組織具有自身生物力學(xué)特性。材料被加工成所需的形狀，并且在植入體內(nèi)后的一定時間內(nèi)仍可保持其形狀。
2.2.2 仿生材料的分類 仿生材料的種類有很多，根據(jù)材料的來源可以分為天然生物材料、合成生物材料和復(fù)合生物材料。
天然生物材料：天然生物材料直接來源于動植物或人體。由于來自于生物體，所以天然材料具有良好的組織相容性，無明顯的毒性，能最終降解為多糖或氨基酸而被機(jī)體吸收，并且不易引起炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。按照結(jié)構(gòu)分類主要可以分為：天然蛋白質(zhì)，如明膠、膠原、彈性蛋白、纖維蛋白;蔡國徽等[5]以膠原Ⅰ為支架材料，建立卵巢癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)模型，膠原Ⅰ具有良好的結(jié)構(gòu)與性能，適宜于卵巢癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)，并能較好地維持卵巢癌細(xì)胞的形態(tài)和功能。多糖類物質(zhì)，如殼聚糖[6]、葡聚糖、糖胺聚糖、細(xì)菌纖維素、透明質(zhì)酸以及其他海藻酸鹽等。天然材料的優(yōu)點在于無抗原性，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，也可通過釋放活性因子來促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及分化，具有良好的生物相容性。但是其缺點也很明顯，例如難以控制降解速率、物化性質(zhì)的單一性、較差的重現(xiàn)性和力學(xué)性能，使其難以大批量生產(chǎn)，同時異種移植的問題以及異種蛋白成分的存在可能會導(dǎo)致免疫反應(yīng)等。
合成生物材料：合成材料種類很多，與天然材料相比，除了能克服天然材料的力學(xué)性能和重復(fù)性差、降解速度和強(qiáng)度不可調(diào)節(jié)等缺點之外，還具有原始材料來源充足，可以被制成各種所需的形狀，構(gòu)建高孔隙率三維支架，可人為修飾和調(diào)控其結(jié)構(gòu)和性能等優(yōu)點。
根據(jù)原始材料的種類可分為：人工合成高分子材料如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚乙內(nèi)酯 (PCL)、聚丙交酯與聚乙交酯共聚物(PLGA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等;無機(jī)非金屬合成材料如鈣磷陶瓷、羥基磷灰石、生物玻璃、磷酸鈣骨水泥、碳材料以及生物惰性的氧化鋁和氧化鋯等;某些金屬材料如鎂合金、鈦及其合金、鎳鈦合金等。小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在聚乙內(nèi)酯靜電紡絲納米纖維支架上具有良好黏附性并呈集落樣生長，其增殖能力及干性標(biāo)記物的表達(dá)均不亞于標(biāo)準(zhǔn)對照組;掃描電鏡顯示，小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在聚乙內(nèi)酯靜電紡絲納米纖維支架材料上呈現(xiàn)出絨毛狀突起的表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，聚乙內(nèi)酯靜電紡絲納米纖維支架可促進(jìn)小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的黏附、自我增殖以及干性維持，兩者具有良好的生物相容性，為聯(lián)合生物支架材料與干細(xì)胞構(gòu)建功能性組織奠定了基礎(chǔ)[7]。相較于天然材料，人工合成材料可塑性更佳，不僅具有良好的力學(xué)性能，而且具有豐富的加工手段，并可通過相對分子質(zhì)量調(diào)節(jié)降解速率。缺點是生物相容性較差、生物活性較低，對細(xì)胞親和力弱，細(xì)胞黏附性較差，降解副產(chǎn)物多種多樣，降解速率快，產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物會改變機(jī)體的微環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞和組織的壞死等[8]。
復(fù)合生物材料：單純應(yīng)用天然材料或者合成材料制造的組織工程支架，或多或少都存在某些無法避免的缺陷，因此，目前廣大學(xué)者已將研究重點轉(zhuǎn)移到使用2種或2種以上不同材料相混合的方法來構(gòu)建復(fù)合材料，以克服單一使用某種材料的不足。復(fù)合材料是集中多種材料的優(yōu)點，彌補(bǔ)各自的不足之處。
常見的復(fù)合材料主要有：同一類生物材料的復(fù)合、不同類別生物材料之間的交叉復(fù)合。天然高分子材料之間構(gòu)建的復(fù)合材料，主要是為了使獲得的組織工程支架從組分上盡可能與天然細(xì)胞外基質(zhì)相類似。采用膠原-殼聚糖、膠原-透明質(zhì)酸、殼聚糖-明膠等天然材料構(gòu)建組織工程支架的研究已有報道。以生物相容性好的殼聚糖作為基質(zhì)材料，與力學(xué)強(qiáng)度較高的聚乳酸復(fù)合制備了網(wǎng)絡(luò)互穿殼聚糖/聚乳酸復(fù)合支架。結(jié)果證明干態(tài)復(fù)合材料的壓縮強(qiáng)度和模量分別比純殼聚糖支架提高了6倍和15倍，能夠促進(jìn)骨缺損的愈合[9]。馮超等[10]研究者利用人發(fā)角蛋白、絲素蛋白以及明膠在合適比例下制備的改良發(fā)角蛋白/絲素蛋白復(fù)合材料力學(xué)特性最佳，具有更為理想的生物相容性及降解速率，無明顯細(xì)胞毒性。還有將羥基磷灰石、膠原、聚丙交酯與聚乙交酯共聚物混和制成的所需形狀的支架，可為細(xì)胞間相互作用及骨連接提供更好的生物條件[11]。 Kikuchi[12]利用滴定法，在合適的溫度和pH值條件下，已經(jīng)成功合成了羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料，并且該復(fù)合材料已經(jīng)通過日本政府的審批，將會用于需要骨填充的患者身上。王嬌娜等[13]利用激光熔融靜電紡絲技術(shù)制備了聚乳酸/聚乙內(nèi)酯及聚乳酸/聚乙內(nèi)酯/納米羥基磷灰石復(fù)合纖維，研究結(jié)果表明，復(fù)合纖維支架的直徑和孔結(jié)構(gòu)具有多樣性，納米羥基磷灰石能夠提高聚乳酸/聚乙內(nèi)酯層壓纖維支架的親水性，改善支架的細(xì)胞相容性，增加細(xì)胞的附著能力，提高細(xì)胞的存活率。
2.3 生物材料的理化性質(zhì)對細(xì)胞行為的影響 在組織工程中，細(xì)胞一般都是在模擬細(xì)胞外基質(zhì)的生物支架材料上人工培養(yǎng)擴(kuò)增誘導(dǎo)植入到體內(nèi)。細(xì)胞在生物支架材料上的生物學(xué)行為，如變形、遷移、增殖、分化等都與細(xì)胞支架材料間相互作用密切相關(guān)。由于細(xì)胞與材料間生物理化因素的存在，細(xì)胞與支架間的相互作用也就受到多種因素影響。支架的力學(xué)性能、化學(xué)及生物物理因素能夠影響細(xì)胞的鋪展形態(tài)和面積以及細(xì)胞間的接觸，進(jìn)一步對細(xì)胞的生長、遷移和分化等行為起到重要的調(diào)節(jié)作用。
2.3.1 生物材料的化學(xué)性質(zhì)對細(xì)胞行為的影響 生物材料表面的化學(xué)官能團(tuán)、親疏水性及帶電性影響著黏附在材料表面的細(xì)胞。許多研究通過改變材料表面的化學(xué)性質(zhì)，可以改變干細(xì)胞在生物材料上黏附、增殖分化及吸附蛋白質(zhì)構(gòu)象的能力[14-15]。
生物材料表面的電荷影響著干細(xì)胞的分化，Guo 等[16]將帶正電的聚烯丙基胺(PAAm)、帶負(fù)電的聚丙烯酸(PAA)、不帶電的聚乙二醇(PEG)用光接枝的方法固定到細(xì)胞培養(yǎng)板的表面，然后將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種到這3種材料表面，在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液的培養(yǎng)條件下，帶正電的聚烯丙基胺和不帶電的聚乙二醇表面支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化，而帶負(fù)電的聚丙烯酸表面不能支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化。材料的化學(xué)性質(zhì)除對蛋白質(zhì)的吸附和細(xì)胞的分化有影響外，同時也是影響細(xì)胞黏附生長行為的重要因素。在材料表面加上生物特異性基團(tuán)如羧基、氨基等，有利于細(xì)胞在材料表面的吸附和分化。
Yan等[17]將NH2、COOH、CH3基團(tuán)接枝到材料表面，由于tallin蛋白是細(xì)胞伸展和黏附的加速器，所以他們通過檢測tallin蛋白在細(xì)胞中的分布來判斷官能基團(tuán)對細(xì)胞在材料表面吸附的影響，實驗結(jié)果顯示接枝NH2、 COOH的基片表面的tallin蛋白量多于接枝CH3的基片表面。同時NH2基團(tuán)有誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向成骨分化的趨勢，而苯基和巰基表面可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化[18]。
本文來源于：《中國組織工程研究》雜于1997年創(chuàng)辦，發(fā)表組織工程研究中關(guān)于干細(xì)胞培養(yǎng)與移植、組織構(gòu)建、材料生物相容性評價(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細(xì)胞)、計算機(jī)輔助骨外科技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)及臨床研究，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和循證醫(yī)學(xué)研究的文章，發(fā)表中國組織工程研究領(lǐng)域一流水平的學(xué)術(shù)、技術(shù)創(chuàng)新成果。
2.3.2 生物材料的物理性質(zhì)對細(xì)胞行為的影響 由于細(xì)胞與材料間生物物理因素的存在，細(xì)胞與支架間的相互作用也就受到多種因素影響，包括基質(zhì)的硬度、表面形貌以及細(xì)胞所受的外力等力學(xué)因素[19]。有研究表明不同硬度的基質(zhì)材料可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向不同譜系細(xì)胞分化。基質(zhì)硬度不僅影響細(xì)胞形態(tài)，也影響了細(xì)胞基因的表達(dá)[20-21]。模擬不同組織硬度的細(xì)胞外基質(zhì)均能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成不同類型的細(xì)胞。
Engler等[20]在表面修飾Ⅰ型膠原蛋白且硬度不同的聚丙烯酰胺水凝膠上分別培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實驗結(jié)果顯示，在沒有誘導(dǎo)因子的條件下，將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在模擬腦組織硬度的軟凝膠(0.1- 1.0 kPa)上，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化;將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于模擬肌肉組織硬度的較硬凝膠(8-17 kPa)上，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肌細(xì)胞方向分化;當(dāng)硬度進(jìn)一步增加，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于模擬類骨質(zhì)硬度的水凝膠(25-40 kPa)上時，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)與成骨細(xì)胞相似的多角形，并且成骨細(xì)胞標(biāo)志分子RUNX2表達(dá)水平上調(diào)，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。
Xue等[22]通過調(diào)整丙烯酰胺(Acrylamide)、交聯(lián)劑 (Cross-linker)、雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)的相對濃度來調(diào)節(jié)基底硬度，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠基底上，結(jié)果顯示成骨分化標(biāo)記基因ALP，Col1α1，Runx2 mRNA水平在硬基底(40.0±3.6) kPa上明顯升高，表明基底硬度就能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化;另外軟骨分化標(biāo)記基因SOX-9，Aggrecan，Collagen Ⅱ和Collagen Ⅹ 的mRNA水平在軟基底(1.6±0.3) kPa上顯著升高， SOX9蛋白表達(dá)在軟基底上明顯升高，Alcian blue染色和Collagen Ⅱ免疫熒光染色結(jié)果均顯示軟基底更有利于軟骨分化。此外，不僅單一的細(xì)胞外基質(zhì)硬度影響著間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，硬度梯度也能在間充質(zhì)干細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。
Navaro等[23]將髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種到2種不同彈性模量 TF 水凝膠 (tetronic 1307- fibrinoge hydrogel)上，彈性模量G0=1 kPa的基底促進(jìn)軟骨的形成，而彈性模量G0=2 kPa的基底有利于向成骨細(xì)胞分化。無論在生理還是在病理上，機(jī)體內(nèi)組織和器官的硬度都存在一定的梯度，因此梯度硬度也能在間充質(zhì)干細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。
Kim等[24]制備剛度是沿縱向從頂部1 kPa到底部 24 kPa的方向逐漸增加的圓柱形聚乙烯醇水凝膠，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到水凝膠上，其中軟基底和硬基底分別有效促進(jìn)了神經(jīng)分化和成骨分化。Tse等[25] 通過構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)硬度梯度的聚烯丙基胺凝膠，發(fā)現(xiàn)多數(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞具有向細(xì)胞外基質(zhì)硬度較大方向遷移的趨勢，并分化為成肌細(xì)胞。另外，Sharma等[26] 利用聚烯丙基胺凝膠模擬類骨質(zhì)的硬度范圍，構(gòu)建了4 種硬度梯度的基質(zhì)，其中70-90 kPa梯度的基質(zhì)能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞標(biāo)志分子RUNX2和堿性磷酸酶，在硬度梯度為10-90 kPa纖連蛋白表面修飾的基質(zhì)中，硬度大于20 kPa的區(qū)域有鈣結(jié)節(jié)形成，說明間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。細(xì)胞外基質(zhì)硬度不僅能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化，還可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向特定細(xì)胞分化。
Arshi等[27]將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在含不同比率單分子交聯(lián)劑的聚二甲基硅氧烷(PDMS)基質(zhì)上，實驗結(jié)果顯示，硬性的細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。此外，基質(zhì)硬度可以維持胚胎干細(xì)胞的干性。 Park等[28]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在硬基質(zhì)上的伸展性和增殖能力都明顯比軟基質(zhì)上減弱，在硬基質(zhì)上生長的間充質(zhì)干細(xì)胞更趨向于向成骨細(xì)胞分化，而軟基質(zhì)上生長的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨方向和成脂方向的分化比例明顯高于硬基質(zhì)上的間充質(zhì)干細(xì)胞。軟基質(zhì)對于Rho誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成和α-actin的裝配沒有明顯的影響。進(jìn)一步的分析表明間充質(zhì)干細(xì)胞在軟基質(zhì)上的黏附力比硬基質(zhì)明顯減弱，這可能是基質(zhì)軟硬度對于干細(xì)胞分化影響的主要機(jī)制。
3 小結(jié) Conclusion
生物材料支架的物理性質(zhì)能夠影響細(xì)胞的增殖、遷移和分化等行為[29-31]，尤其是硬度調(diào)控干細(xì)胞分化對組織工程及再生醫(yī)學(xué)都具有極大的啟示。目前，對于細(xì)胞外基質(zhì)硬度調(diào)控干細(xì)胞分化還有許多方面需要深入的探討，如除了材料硬度這一因素能調(diào)控干細(xì)胞分化外，還有其他物理因素、化學(xué)因素影響著干細(xì)胞的分化，材料硬度單獨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等方面與正常的成熟細(xì)胞相比有較大的差異，因此需要尋找更多與細(xì)胞外基質(zhì)硬度共同作用的生物化學(xué)和物理因素，精確控制細(xì)胞行為。如何能夠制備出與體內(nèi)生理環(huán)境更加相似的支架材料值得深入研究和探討。
組織工程生物材料支架的最終目的是用于臨床治療，組分上盡可能與細(xì)胞外基質(zhì)相類似，減小與體內(nèi)環(huán)境的差異性。除此之外，還要必須考慮一些在設(shè)計和制備中的實際問題，如材料的機(jī)械性能是否有利于實際應(yīng)用的操作，材料是否容易消毒，材料是否可以大規(guī)模加工生產(chǎn)，是組織工程材料能夠用于臨床的根本目的。——論文作者：鄭力恒1，2 ，吳 昊2，3 ，尚玉攀4 ，張嘉晴4