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摘 要： 摘要:本研究旨在利用金標銀染顯色技術，構建同時檢測禽白血病病毒(ALV)、雞馬立克病病毒(MDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的可視化基因芯片。利用T-A法分別克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2
摘要:本研究旨在利用金標銀染顯色技術，構建同時檢測禽白血病病毒(ALV)、雞馬立克病病毒(MDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的可視化基因芯片。利用T-A法分別克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因，并利用本實驗室已保存的AIV-np、NDV-f、ILTV-tk基因序列，設計寡核苷酸探針，制備ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV基因芯片陣列。引入生物素標記的引物進行PCR擴增，并與芯片進行雜交銀染顯色，肉眼觀察檢測結果，并對芯片的特異性、敏感性、穩定性進行評價，以及臨床初步驗證。成功克隆ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2共3個靶基因，測序鑒定其正確性。發現寡核苷酸探針最優使用濃度為50μmol·L-1，40℃條件下雜交2h，Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液的質量濃度為4μg·mL-1，銀染5min，可見明顯的檢測信號。特異性試驗顯示，ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之間無交叉反應，且以雞傳染性支氣管炎病毒為模板制備的PCR擴增標記不與ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV芯片雜交。芯片檢測的靈敏度為1pg·μL-1。芯片在常溫條件下保存60d，在4℃條件下保存75d仍可進行有效檢測。臨床病料檢測結果與PCR檢測結果一致。本研究成功構建同時檢測ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金標銀染可視化基因芯片，并確定其最佳反應條件，為臨床標準化應用奠定了基礎。
關鍵詞:家禽;病毒檢測;可視化芯片;金標銀染
隨著我國家禽養殖業集約化和規模程度的提高，家禽呼吸和免疫抑制類疾病的發病率逐漸上升。禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus，ILTV)是引發家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。傳染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)、雞馬立克病病毒(Marek’sdiseasevirus，MDV)、禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)是引發家禽免疫抑制病的主要病毒性病原，臨床癥狀相似，難以鑒別診斷，并表現出從單一的病原感染向多種病原混合感染方向發展的趨勢。如J亞群ALV的env基因的可變區不斷地發生變化，導致該病毒的抗原性不斷地進化和改變[1-2]。2013年，新的AIV亞型H7N9被發現[3-4]。新出現的毒株，給家禽業造成了巨大的經濟損失，也嚴重威脅著人類的健康。
基因芯片是繼PCR后發展起來的一項具有快速、特異性好、敏感性強及高通量等優點的自動化基因檢測技術，已被廣泛地應用于藥物開發、基因突變、基因表達等方面[5]。目前基因芯片在禽類病毒檢測方面的應用大多是基于熒光掃描的基因芯片技術或酶與底物可視化顯色技術[3，6-9]。然而熒光掃描比較昂貴，酶和底物顯色所使用的尼龍膜或者纖維素性薄膜芯片不易保存，這極大地限制了芯片診斷在臨床診斷中的應用。近年來，關于金標銀染可視化顯色技術與基因芯片相結合的文獻報道呈遞增趨勢[10-11]，因其檢測結果可脫離昂貴的傳統熒光掃描儀，且操作簡單，高靈敏性等特點，已廣泛地應用于基因突變分析、疾病診斷、藥物篩選等方面[12-14]，因此越來越廣泛地被人們用于疾病的檢測[2]。
考慮到家禽疫病防控急需，且目前尚未見ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV六種病毒金標銀染可視化基因芯片的報道。因此，本研究以ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV以及ILTV為研究對象，通過金標銀染顯色，構建了一套能夠同時檢測這六種禽類病毒的可視化基因芯片檢測技術，為家禽呼吸道和免疫抑制病的臨床標準化診斷應用奠定基礎，從而保障我國養禽業的健康發展。
1材料與方法
1.1生物材料
靶基因重組質粒T/AIV-np、T/DNV-f、T/ILTVtk、λ定位基因重組質粒，大腸桿菌DH5α由四川農業大學豬病研究中心構建并保存。MDV和IBDV組織液由四川農業大學動物醫學院黃勇教授提供。ALV的DNA核酸由山東農業大學崔治中教授提供。臨床病料采自四川安岳、大邑、彭州、蒲江等地區疑似禽白血病、馬立克病、雞傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫和雞傳染性喉氣管炎患病雞的喉氣管、肺、脾、肝、腎及法氏囊組織。
1.2主要試劑
總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、普通DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScriptRTReagentKit購自寶生物工程(大連)有限公司;質粒提取試劑盒購自美國Omega公司;晶芯芯片點樣液、晶芯光學級醛基基片、晶芯12樣品芯片圍欄購自北京博奧生物有限公司;金標鏈霉親和素Nanogold-Streptavidin購自美國Nanoprobes公司;銀染試劑SilverbufferA、SilverbufferB購自美國Sigma公司;封閉液按照0.5%BH4Na，25%Ethanol，0.75×PBS比例配制。
1.3主要儀器
晶芯SmartArrayerTM16，微陣列芯片點樣系統CapitalbioCorporation購自北京博奧生物公司;分子雜交儀購自美國Thermo公司;芯片雜交盒及雜交相關產品購自北京Capitalbio生物有限公司;高純氮氣瓶購自四川冠峰氣體有限公司。
1.4ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因的克隆鑒定
λ定位基因的引物參考曹三杰[15]設計合成。利用DNAStar軟件的Megalign對NCBI收錄的ALV、MDV、IBDV毒株的基因序列進行比對分析，以Primer5.0設計3對引物(ALV的env基因，MDV的meq基因，IBDV的vp2基因)，靶基因擴增長度在200～800bp之間，Tm為(55±5)℃，引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成(表1)，用生物素對靶基因下游引物的5'端進行修飾。
提取IBDV毒株的總RNA，并將其反轉錄為cDNA，提取ALV、MDV的DNA，以cDNA/DNA為模板擴增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收產物連接pMD19-TSimple載體，并轉化DH5α感受態細胞，提取質粒后陽性的重組質粒送上海生物工程有限公司測序后保存備用。取ALVenv、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f、ILTV-tk和λ菌落分別進行菌液PCR，用生物素對靶基因下游引物的5'端進行修飾。
1.5探針設計與芯片制備
針對每個靶基因序列片段，各選取一條單鏈核酸序列作為寡核苷酸探針，確保各探針的Tm值為75℃±5℃，長度為45bp左右，并在每條寡核苷酸探針的5'端添加15個T堿基作為連接臂，同時進行氨基化修飾。探針由上海生物工程有限公司合成(表2)。
將點樣緩沖液和ddH2O按1∶4的比例混勻，用以稀釋合成的寡核苷酸探針，調整其終濃度為50μmol·L-1，按照設計好的檢測陣列排布進行非接觸噴樣方式噴樣(圖1)。噴樣結束后，紫外交聯5min，芯片置于濕盒內，37℃水合過夜。隨后，在37℃條件下，封閉液封閉30min。取出芯片，超純水清洗5次。自然干燥，置于4℃保存備用。
1.6可視化基因芯片的檢測
用生物素標記的引物分別擴增ALV-env、MDVmeq、IBDV-vp2、NDV-f、AIV-np和ILTV-tk六種靶基因，并將其PCR產物等量混勻，于100℃水浴變性5min，立即冰浴3min，防止DNA雙鏈復性。隨后將PCR產物混合液加入含圍欄固定的芯片陣列區域，40℃條件下雜交120min，雜交結束后，超純水洗凈后自然干燥。將質量濃度為4μg·mL-1的NanogoldStreptavidin的鏈霉親和素溶液緩慢加入到芯片對應的陣列區域，37℃孵育30min。超純水洗凈后自然干燥。避光條件下，將銀染試劑中的SilverbufferA和SilverbufferB等體積混勻，取200μL混合液加入芯片陣列區域，觀察并記錄芯片上可視化信號出現的時間。當可視化芯片陽性對照相應位置出現明顯的雜交信號，而陰性對照相應位置無明顯的雜交信號時，清洗芯片，終止顯色。眼觀可視化芯片結果，在芯片相應位置若出現明顯黑色銀染信號，即判定為雜交陽性，反之則判定為雜交陰性。
1.7可視化基因芯片的質量評價
1.7.1特異性試驗ALV-env、MDV-meq、IBDVvp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk的單鏈靶基因，單獨與芯片進行雜交顯色，眼觀雜交結果。
1.7.2敏感性試驗使用ddH2O將提取的靶基因質粒(初始質量濃度為1ng·μL-1)依次進行101～105倍稀釋，PCR擴增標記，擴增產物混勻后與芯片進行雜交顯色，眼觀雜交結果。
1.7.3穩定性試驗將同一批生產的芯片，分別放置在常溫和4℃條件下密封保存。分別在30、60、75、90d隨機抽出一張芯片，按照“1.6”步驟，與生物素標記的靶基因進行雜交，銀染顯色眼觀結果，以評價芯片的穩定性。
以上特異性、敏感性及穩定性試驗均重復三次。
1.8臨床樣品的初步驗證
將收集的51份疑似患禽免疫抑制性和呼吸道疾病的青腳麻雞、白羽肉雞和烏雞的喉氣管、肺、腎、脾、肝、法氏囊組織，混合研磨勻漿后，滅菌的PBS勻漿稀釋，-70℃條件下反復凍融三次，4℃，12000r·min-1離心10min，取上清500μL進行RNA和DNA的提取。提取的RNA反轉錄為cDNA。分別用臨床樣品的PCR技術和基因芯片同時進行檢測，對比兩者檢測結果。
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2結果
2.1靶基因的擴增、克隆及重組質粒菌復蘇鑒定
成功擴增ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2靶基因片段，測序結果顯示，與NCBI中收錄的同一病毒的不同毒株靶基因序列具有99%以上的相似性(表3)。對ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDVf、ILTV-tk進行菌液PCR擴增結果顯示(圖2)，PCR擴增的目的片段與預期大小一致。
2.2基因芯片制備的初檢
2.2.1陽性定位基因的檢測以λDNA定位基因為模板進行靶基因擴增標記，將λDNA擴增產物與含6種病毒探針的芯片進行雜交，銀染顯色，肉眼觀察試驗結果。結果顯示陽性質控λDNA定位基因雜交斑點明顯可見，陰性對照和其他探針斑點沒有可見雜交斑點(圖3)。表明本研究制備的醛基基片及陽性定位基因質量可靠。
2.2.2共檢芯片全基因的檢測6種病毒6個探針基因的全部探針位點均可以看到明顯的雜交斑點，陽性對照斑點明顯，陰性對照沒有可見雜交斑點，表明制備的可視化共檢芯片、選用探針基因質量可靠(圖4)。
2.3可視化基因芯片的質量評價
2.3.1特異性試驗評價ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk單獨與可視化芯片雜交時只在芯片的相應位置出現了肉眼可見的雜交斑點，且各個探針之間無非特異性雜交的情況。使用IBV-n基因擴增產物與可視化芯片雜交后，芯片的相應位置無肉眼可見雜交信號斑點，雜交結果呈陰性(圖5)。說明本試驗構建的基因芯片具有高的特異性。