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摘 要： 相信大家對深市體外細胞毒性以及顏面贗復體粘接劑等這些信息不是很了解，怎樣來充分的認識呢?又該怎樣來加強這方面的管理治療措施呢?本文在此做了相應的介紹。文章選自：《中華實驗和臨床病毒學雜志》,《中華實驗和臨床病毒學雜志》為中國科學技術協會主管、
相信大家對深市體外細胞毒性以及顏面贗復體粘接劑等這些信息不是很了解，怎樣來充分的認識呢?又該怎樣來加強這方面的管理治療措施呢?本文在此做了相應的介紹。文章選自：《中華實驗和臨床病毒學雜志》,《中華實驗和臨床病毒學雜志》為中國科學技術協會主管、中華醫學會主辦的醫學病毒學專業學術期刊，國內外公開發行。該刊為雙月刊，主要報道我國醫學病毒學的應用及基礎理論研究，人類病毒性疾病預防、診斷、流行病及臨床治療等方面的新技術、新方法、新進展、新成果，以及國外在該領域的最新研究進展。
摘要：由于生物材料容易浸出能引起組織反應或炎癥反應的物質,這些物質大多是原料單體、小分子聚合物、溶劑等,所以生物材料在應用于人體之前,都必須經過嚴格的檢驗,除臨床應用所要求的機械及理化性能外,還應具備良好的生物相容性[7]. 國際標準化組織發布了ISO 10993醫療器械生物學評價系列標準中,細胞毒性試驗以其簡便、快捷、靈敏性高、節省動物等優點被列為首選試驗項目.
關鍵詞：體外細胞毒性,醫學論文,論文發表
顏面贗復體的固位中組織倒凹和機械固位多用作輔助方式,種植體固位雖然是顏面贗復體首選的固位方式[1],但由于多種原因使患者不能接受種植手術時, 就需依賴粘接固位. 傳統的贗復體粘接劑中,聚丙烯酸酯類粘接劑價廉,粘接強度尚可,但皮膚上的粘接劑殘留較難去除[2];有機硅類粘接劑粘接強度高,皮膚殘留少,但含有機溶劑具有潛在刺激性[3]. 我們通過乳液聚合的方法合成有機硅改性聚丙烯酸酯類的顏面贗復體粘接劑1(facial prosthesisskin adhesive1,FPSA1),并參照國際標準化組織發布的醫療器械生物學評價標準,進行體外細胞毒性試驗[4],將小鼠肺成纖維細胞(L929)在離體狀態下進行培養,以探討FPSA1浸提液對L929細胞生物學活性的影響,評價其生物的相容性.
1材料和方法
1.1材料FPSA1 (第四軍醫大學口腔醫學院與西北工業大學聯合研制);無菌濾紙, 高壓蒸汽滅菌后備用. L929細胞株(第四軍醫大學基礎部免疫學教研室);DMEM培養液(美國Gibco公司);含100 mL/L的標準胎牛血清(FBS,杭州四季青公司);100 kU/L氨芐青霉素、100 kU/L硫酸鏈霉素, pH=7.2~7.4;胰蛋白酶,四甲基偶氮唑鹽(MTT) (美國Sigma公司);四甲基偶氮唑鹽溶液,實驗前用磷酸鹽緩沖液(PBS)新鮮配制, 濃度為5 g/L,過濾除菌后4℃避光保存,1 wk內使用. 二甲基亞砜(DMSO, 北京索萊寶公司); 倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS TH4200);超凈工作臺(AIR TECH,蘇凈集團安泰公司);CO2培養箱(HERA cell 150, Germany);25 cm2細胞培養瓶,96孔細胞培養板(NUNC,丹麥).
1.2方法
1.2.1浸提液制備將無菌濾紙裁成1 cm×1 cm試樣備用, 按每面涂50 μL的粘接劑使濾紙浸漬均勻,清潔空氣輕吹2~3 min,待粘接劑由白色乳液變至無色透明膠膜,依照ISO 1099312樣品制備要求[5],試樣按表面積與浸提介質比6 cm2/mL加入含100 mL/L FBS的DMEM培養液中,另將未涂粘接劑的無菌濾紙作為陰性對照按同樣比例浸于相同培養液,放置在37℃,50 mL/L CO2培養箱內浸提72 h,分別得到1000 mL/L FPSA1浸提液和陰性對照組浸提液,過濾除菌. 再將1000 mL/L浸提液經DMEM培養液稀釋成500,750 mL/L濃度浸提液備用.
1.2.2細胞培養將對數生長期的L929細胞經2.5 mL/L胰酶消化、吹打分散后計數,用含100 mL/L FBS的DMEM培養液配成濃度為1×107/L的細胞懸液,按每孔100 μL的細胞懸液接種于96孔培養板上,放入37℃,50 mL/L CO2培養箱中. 四周邊緣孔不接種細胞,每孔加入100 μL的DMEM培養液,起邊緣封閉作用.
1.2.3MTT測試細胞培養24 h后棄去原培養液,用PBS洗滌2次,進行培養液交換,按每孔200 μL分別加入500,750 mL/L的FPSA1浸提液,另設陰性和陽性對照組,分別加入等量無菌濾紙浸提液和含6.4 mL/L苯酚的培養液,每組重復6孔,常規培養,每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及增殖情況. 分別于加樣后2,4,7 d取出96孔板,在受試孔中每孔加入20 μL的MTT溶液,37℃,50 mL/L CO2培養箱中保溫4 h后棄去舊液,每孔加入150 μL的DMSO,振蕩10 min,在多道掃描酶標儀上測A490 nm值,計算細胞的相對增殖率(RGR). RGR(%)=(實驗組A490 nm/陰性對照組A490 nm)×100%,細胞毒性分級按如下標準[6]評價: RGR≥100為0級;80~99為1級;50~79為2級;30~49為3級;0~29為4級.
統計學處理:用SPSS12.0統計分析軟件,對數據采用方差分析和Tukey多重比較檢驗 (α=0.05).
2結果
2.1MTT測定加樣后2,4,7 d,陽性對照組與其余各組的A值之間均有顯著性差異(P<0.01), 500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液組之間A490 nm差異無統計學意義(P>0.05,表1);在各時相500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液組的RGR均大于80%,參照標準評分FPSA1的細胞毒性為1級,各組細胞RGR及毒性評級結果見表2.
表1FPSA1與對照組的A490 nm值(略)
bP<0.01 vs 陰性對照, 500 mL/L FPSA1,750 mL/L FPSA1. FPSA1: 顏面贗復體粘接劑1.
表2FPSA1與對照組的RGR及細胞毒性等級(略)
bP<0.01 vs 陰性對照,500 mL/L FPSA1,750 mL/L FPSA1. FPSA1: 顏面贗復體粘接劑1.
2.2倒置顯微鏡觀察細胞生長情況加樣后2,4,7 d,在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,陰性對照組L929細胞形態正常,呈梭形,細胞突充分伸展,隨著時間延長,細胞數量增加(圖1A);500 mL/L FPSA1浸提液組細胞形態正常,生長良好,750 mL/L FPSA1浸提液組局部可見少量細胞出現溶解或壞死(圖1B,C);陽性對照組細胞數量明顯減少,大量細胞出現固縮、壞死、崩解(圖1D).
3討論
MTT法應用材料浸提液檢測其細胞毒性,對受試材料溶出物的毒性檢測敏感性較高,也比較符合動物體內的毒性實驗結果,是一種較好的體外評價生物材料細胞毒性的研究方法[8]. L929細胞具有傳代穩定、繁殖迅速、體外培養條件低、能為許多材料細胞毒性所共用等優點,成為細胞毒性試驗中應用最早且使用最廣泛的細胞.
A: 陰性對照組; B: 50 mL/L FPSA1浸提液組; C: 750 mL/L FPSA1浸提液組; D: 陽性對照組.
圖1倒置顯微鏡觀察加樣后7 d各組L929細胞形態學變化×100(略)
我們采用500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液進行MTT實驗,以檢測細胞毒性是否與材料溶出物有關,以及溶出物濃度與細胞毒性的劑量依賴關系,可以比較全面地評價FPSA1的細胞毒性. 經500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液培養的L929細胞,在加樣2,4和7 d后,細胞RGR均在80%以上,細胞毒性為1級,各濃度浸提液組之間RGR無顯著差異,提示L929細胞增殖與FPSA1浸提液的濃度無明顯相關,符合生物材料的醫用標準. 與陰性對照組相比,750 mL/L FPSA1浸提液組局部出現少量細胞溶解或壞死,這可能是由于在細胞毒性試驗中,通常隨著浸提液濃度的增加,細胞毒性也會相應增加的緣故[9].
FPSA1為有機硅改性的聚丙烯酸酯類粘接劑,是用含雙鍵的有機硅單體與丙烯酸酯單體,通過自由基引發的乳液聚合反應合成的. 在聚合反應過程中加入了離子型和非離子型的乳化劑,其中離子型乳化劑在制備粘接劑浸提液時可促進膠膜吸水溶解,使得粘接劑膠膜中殘留的丙烯酸酯單體或其它助劑析出,從而表現出輕微的細胞毒性. 我們的結果提示在粘接劑合成過程中應盡量提高共聚單體功能團的交聯程度即提高單體轉化率,或采取相應措施以減少粘接劑中的單體殘留,同時還應提高顏面贗復體粘接劑的耐水性能. 這一方面可通過提高聚合物中有機硅的含量來實現,另一方面可以在乳液聚合反應中使用反應型乳化劑以減少離子型乳化劑的使用量. 反應型乳化劑在乳化劑分子中含有能發生自由基聚合反應的雙鍵,在反應時參與單體共聚,不以游離聚合物粒子形式存在,從而改善粘接劑的性能[5,8].
綜上所述,本研究采用MTT法評價細胞毒性,其結果顯示FPSA1無明顯的細胞毒性,具有良好的細胞相容性,是一種具有發展前景的顏面贗復體粘接材料.