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摘 要： 正確認識免疫抑制劑姜黃素逆轉胰島素抵抗上的研究，有關現在的新實驗管理上有什么影響及意義呢?文章是有關醫學職稱方面的論文。 摘要：胰島素抵抗(IR)及胰島?茁細胞功能減退是2型糖尿病發病機理的重要環節[9],目前被認為是一個慢性非特異性炎癥過程,胰島素對
正確認識免疫抑制劑姜黃素逆轉胰島素抵抗上的研究，有關現在的新實驗管理上有什么影響及意義呢?文章是有關醫學職稱方面的論文。
摘要：胰島素抵抗(IR)及胰島?茁細胞功能減退是2型糖尿病發病機理的重要環節[9],目前被認為是一個慢性非特異性炎癥過程,胰島素對胰島素敏感組織作用的缺陷(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)會導致慢性、低水平炎癥狀態的惡化,任何與慢性炎癥有關的過程都會削弱胰島素的作用,作為惡性循環,胰島素抵抗又會使炎癥惡化。
關鍵詞：姜黃素,胰島素,醫學職稱論文
1 材料與方法
姜黃(Curcuma longa L.)是常用中藥,臨床上用于活血、行氣、通經、止痛。姜黃素(curcumin)是一種黃色色素,從姜黃中提取得到的主要有效成分。近年來,大量研究發現它具有免疫調節、抗氧化、抗炎及抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等生理和藥理作用[1-4]。在實驗室資料中姜黃素是良好的免疫調節劑,并有結果提示姜黃素可以抑制宿主抗移植物反應,而且提高受體動物的存活率[5,6]。在實驗研究中,炎癥又與胰島素抵抗密切相關[7,8]。炎癥被證實是代謝綜合征的共同土壤,聯想到許多抗炎藥物如阿司匹林可以逆轉胰島素抵抗,本文嘗試利用姜黃素治療肥胖合并極度胰島素抵抗的炎癥模型,并對姜黃素逆轉胰島素抵抗的機制作初步探討。
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1.1 材 料
1.1.1 姜黃素 購于印度亞洲公司(純度99%)。
1.1.2 動物 Obob雄性小鼠16只,8周齡、空腹體質量(33~38 g),購自南京國家模式動物中心,用含脂肪6.4%的標準飼料飼養,實驗前1周紀錄小鼠的飼料攝取、空腹血糖、空腹胰島素水平及體量等。
1.1.3 FAO細胞 購自 The American Type Culture Collection(ATCC)。
1.1.4 試劑 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗體由Steven Shoelson實驗室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰島素購自Sigma, St. Louis USA, I-?資B?琢 抗體,IKK?酌抗體,購于 Santa Cruz, CA, GST-I-?資B(1-54) 底物由Boston Biologicals, Wellesley, MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 體外細胞實驗 FAO細胞使用培養液 DMEM(購自 Gibco公司),細胞置于37 ℃,5%CO2的培養箱中培養。在10 cm 培養皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高濃度葡萄糖(25 mmol/L)的培養液中培養至80%重疊率,經5 mL 0.1%BSA孵育16 h后接受不同濃度(0~40 umol/L)的姜黃素預處理,然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激處理,于20 min后用預冷的PBS終止,并收集細胞,用于制作蛋白勻漿,備用, I-?資B?琢的水平用免疫印跡的灰度表示。NF-?資B的活性用20 min內試驗細胞和對照細胞I-?資B?琢灰度差值表示。
1.2.2 動物實驗 利用食物參入法制成含2%姜黃素的顆粒飼料(Lab Diets, 5008),低溫保存。動物飼養環境為中央通氣,層流環境,恒溫(23 ℃)、恒濕,12 h明暗光照循環,24 h隨意飲食環境. 動物購入后第5天開始接受口服葡萄糖耐量試驗,并留取空腹血漿作血漿胰島素水平,和其它循環因子的檢查。在驗證空腹血糖和胰島素水平后動物被隨機分成兩組,并接受姜黃素治療,對照組用顆粒飼料5008作為對照。每天記錄動物的攝食量,每3周測量空腹血糖并留取空腹血漿1次, 第6周空腹狀態下進行第2次口服葡萄糖耐量試驗,并留取空腹血漿。試驗后繼續接受姜黃素治療,第7周于空腹狀態下接受5 U/kg胰島素富強注射,注射后5 min整,用斷頸法迅速處死動物, 留取肝臟經液氮過渡后在-80 ℃低溫冰箱保存,作胰島素信號分析之用。血漿多種循環炎癥細胞因子的檢查用Linco Research 的Luminex 試劑盒并采用Luminex 200 監測結果。
1.2.3 免疫印跡 細胞或組織裂解液(30 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 7.4。蛋白酶抑制劑由1 mmol/L PMSF, 3 ?滋mol/L aprotinin, 5 ?滋mol/L pepstatin, 10 ?滋mol/L leupeptin, 25 mmol/L Benzamidin, 2 mmol/L Na-vanadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L Ammonium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA)裂解細胞, SDS-聚丙烯酰胺凝膠(6%),蛋白加熱變性后每孔加30 ?滋g, 電轉移儀將蛋白轉到PVDF膜。5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液洗膜,加一抗, 4 ℃孵育過夜,TBS-T緩沖液洗膜,加過氧化物酶標記的IgG 抗體(購自Amersham USA),室溫1 h,TBS-T緩沖液洗膜,加ECL 1 min,暗室顯影2~3 min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統攝像。
1.2.4 統計學分析 采用t檢驗。
2 結 果
2. 1 姜黃素抑制NF-?資B的量效和時效關系
Fao細胞在10 cm2 培養皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高濃度葡萄糖的培養液中培養至80%重疊,經5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黃素預處理:劑量關系用梯度濃度如圖1所示,時效曲線用30 μmol/L。預處理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激處理,于20 min后用預冷的FBS終止,并收集細胞,用于制作蛋白勻漿。用免疫印跡檢測勻漿內I-?資?注?琢的水平。如圖1A所示:20 μmol/L姜黃素20 min預處理能夠抑制TNF刺激的I?資?注?琢的降解。從姜黃素的時效關系圖1B可見,姜黃素有效劑量30 μmol/L對NF-κB的抑制作用在30~60 min時最強。
2. 2 姜黃素以逆轉肥胖小鼠的胰島素抵抗
經過6周姜黃素的治療,小鼠的空腹血糖水平沒有明顯下降,但空腹胰島素的水平下降約30%(圖2),口服葡萄糖耐量曲線的水平也明顯下降(圖2A),曲線下面積的比較有明顯差異(P< 0.01)。由空腹血糖和胰島素水平計算的HOMA指數[用FBS(mmol/L) ×胰島素(mmol/L)/22.5 計算]也呈明顯降低(P< 0.05,圖2C),提示小鼠對胰島素抵抗的水平得到明顯改善。
2. 3 姜黃素對循環細胞因子的影響
Obob 小鼠治療6周后的空腹血漿用Linco Research Luminex 試劑盒同時檢測細胞因子IL-1?茁,IL-6 和 TNF?琢的水平。如圖3所示:盡管循環胰島素的水平明顯下降,但TNF?琢 [(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL]水平沒有明顯改變,與之對應,循環中IL-1?茁[(33.9±3.2)pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] 和IL-6 [(72.1±9.8)pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL]水平明顯被抑制(P< 0.05)。
2. 4 姜黃素為胰島素信號的增效劑
經胰島素刺激的肝臟組織在液氮下作粉碎并以1% Triton X100 RAPA(含有全部蛋白酶抑制劑,和蛋白磷酸酶抑制劑)緩沖液在冰點勻漿。經全速4 ℃離心30 min取上清液(1 mg 蛋白質)作IRS-1和 IR聯合免疫沉淀。經上樣緩沖液釋放的沉淀目標蛋白質經6%的SDS-PAGE 分離,轉移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗體作免疫印跡。如圖4所示:胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯升高, 而胰島素受體的磷酸化水平沒有明顯改變。與IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明顯升高,AKT的磷酸化的水平也明顯升高。
3 討 論
在抗炎藥物對胰島素抵抗有逆轉作用的報道之后, 我們探索新的抗炎藥物對胰島素抵抗的治療作用, 姜黃素是繼阿司匹林后又一個具有類似協同作用的活性成分[11]。在姜黃素治療6周后,盡管治療組和對照組的體重沒有明顯改善,但小鼠空腹血糖的水平明顯下降,而且胰島素的水平也明顯降低,提示胰島素的敏感性明顯升高,葡萄糖耐量曲線在治療后也明顯改善,說明小鼠整體對葡萄糖的處理能力明顯升高,即obob 小鼠的胰島素抵抗的水平得到明顯改善。這些都進一步說明姜黃素治療改善肥胖誘導的胰島素抵抗。
研究證實NF-?資B是啟動和控制炎癥的主要核轉錄因子,在非激活條件下,NF-?資B和胞漿內一種被稱為NF-?資B的抑制物(I-?資B)的蛋白質結合處于無功能狀態。我們利用胰島素敏感組織來源的細胞系FAO,驗證了姜黃素能夠抑制TNF?琢刺激的I?資B?琢的降解,繼而抑制NF-?資B的活性, 我們推測在高度肥胖NF-?資B高度激活的肥胖小鼠obob 體內,姜黃素可能具有更加明顯的改善代謝的作用。
在NF-?資B激活的模型上我們證實炎癥激發的高水平循環細胞因子是系統性胰島素抵抗的原因。采用細胞因子的中和抗體可以逆轉胰島素抵抗,在NF-?資B抑制型模型,胰島素敏感性升高,而且循環中細胞因子的水平較低。在肥胖發生過程中,NF-?資B 活性與動物的體重呈正相關。Obob 小鼠的肝臟,脂肪以及淋巴組織中NF-?資B的活性水平升高,循環細胞因子的水平增高,這些都說明炎癥介質與胰島素抵抗的關系。經姜黃素治療的肥胖動物循環中細胞因子IL-1, IL-6水平均明顯下降,由于IL-1和IL-6是NF-?資B活性調控的重要因子,因此,我們認為姜黃素在胞漿內有多個作用靶點,通過對上述細胞因子的抑制作用,影響NF-?資B 的活性,繼而達到逆轉胰島素抵抗和改善胰島素敏感性的作用。在肝臟組織的胰島素信號檢測中,胰島素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明顯升高,AKT的活性也明顯增強。這些結果都進一步說明肥胖小鼠胰島素的敏感性在治療后得到了改善,姜黃素能提高obob小鼠胰島素的敏感性,姜黃素作為一個免疫調節劑用于抑制免疫排斥的同時,對系統性炎癥也有抑制作用,可能是通過抑制NF-?資B來改善胰島素敏感性的。