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摘 要： 〔作者簡介〕 和占龍，1972 年生，研究員，教授，云南省技術創(chuàng)新人才，國家自然科學基金評審專家?guī)臁医逃考霸颇?/font>
〔作者簡介〕 和占龍，1972 年生，研究員，教授，云南省技術創(chuàng)新人才，國家自然科學基金評審專家?guī)臁医逃考霸颇鲜 ⒗ッ魇袑嶒瀯游飳＜規(guī)斐蓡T，云南省實驗動物學會副秘書長。長期從事醫(yī)學實驗動物及人類疾病靈長類動物模型的開發(fā)及應用研究，現(xiàn)任中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所全國醫(yī)學靈長類中心實驗動物部主任。作為主要研究人員參加國家科技部 (863)項目、國家科技重大專項、國家及省級自然基金資助項目等 10 余項，獲得云南省科技進步一等獎 1 項、昆明市科技進步一等獎 1 項，云南省科技進步三等獎 4 項，中國實驗動物科技一等獎、二等獎各 1 項，專利及軟件著作權 6 項，發(fā)表論文 90 余篇;其中 SCI 論文 27 篇，第一(通訊)作者 8 篇;參編《實驗猴正常組織學圖譜》和《恒河猴組織學》專著 2 部，參與制訂云南省《實驗動物病理學檢測》地方標準 1 部。完成 EV71、輪狀病毒、流感、糖尿病、帕金森病、老年癡呆等動物模型建立、疫苗研發(fā)和免疫原性等評價工作。主要研究方向為人類疾病的靈長類動物模型建立、評價與比較醫(yī)學研究。
單純皰疹病毒( herpes simplex virus，HSV) 屬致病性人類 α 皰疹病毒，能引起齦口炎、角膜結(jié)膜、腦炎以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染等多種疾病。 HSV 包 括 2 個 血 清 型: Ⅰ 型 ( HSV - 1 ) 和 Ⅱ 型 (HSV - 2)，可以在三叉及骶尾神經(jīng)節(jié)等組織內(nèi)建立終身潛伏狀態(tài)，并且周期性復活而引起疾病復發(fā)[1]。感染 HSV - 1 主要引起口唇及顏面、腰部以上的部位感染;感染 HSV - 2 者 80% 以上引起生殖系統(tǒng)感染，主要通過性傳播。全球 HSV - 1 的感染率約為 90% ，其中美國約為 65% ，歐洲為 52% ～ 67% ;HSV - 2 感染比 HSV - 1 感 染 少，在美國和歐洲的感染率為 10% ～ 20%[2，3]。盡管現(xiàn)有的抗病毒干預手段可以在一定程度上控制病情和傳播，但無法從根本上治愈，亟待有效的疫苗來限制 HSV 病毒的感染、傳播及復發(fā)。
一、疫苗的研究現(xiàn)狀
作為一種理想的 HSV 疫苗，應該可以誘發(fā)消除性免疫，亦即在 HSV 侵入人類機體的各種途徑如生殖道、口鼻黏膜等時都能夠誘發(fā)有效的免疫應答，并對病毒的再感染具有抵抗力。自 20 世紀 20 年代開始，HSV - 1 和 HSV - 2 疫苗已經(jīng)開始在實驗室進行研究，但其有效性并沒有得到證實[4]。最近的 30 年里，隨著免疫學與細胞生物學技術的飛速發(fā)展，有了更多新的手段來研制新型 HSV 疫苗。比如近年來就有研究人員把目光放在關注感染與非感染者間 T 細胞識別位點是否具有差異性，因為這與病毒的反復暴發(fā)密切相關[5]。目前研究較多且經(jīng)過臨床評估的疫苗主要有亞單位疫苗( subunit vaccine)、減毒活疫苗 (attenuated live virus vaccine)、復 制 缺 陷 病 毒 疫 苗 (replication defective virus vaccine)、DNA 疫苗(DNA vaccine)以及載體疫苗( vector vaccine)，這些疫苗在不斷建立起來的動物模型上取得重要的成效，但各有優(yōu)缺點[6]。
1. 亞單位疫苗:研究重點主要集中在病毒進入細胞所必須的糖蛋白 gB 和 gD 上，在已感染 HSV 的患者體內(nèi)，它們主要激活 CD4 + T 細胞，誘導體液免疫和細胞免疫。目前較為普遍并且已經(jīng)進入Ⅲ期臨床的是由 GlaxoSmithKline 公 司 生 產(chǎn) 的 gD2 - 硫 酸 鋁鉀 - 3dMPL 疫苗，所用佐劑 3 - dMPL(3 - O 脫酰單磷酸脂質(zhì) A)能夠增強 Th1 應答，雖然可以明顯減輕首次感染 HSV - 2 的癥狀，但該結(jié)果僅限于 HSV - 1 和 HSV - 2 血清學反應均屬陰性的女性中[7]。
2. 減毒活疫苗:具有多種抗原物質(zhì)和表位，可以誘發(fā) Th1 免疫并且在男性和女性中均有治療活性，對復發(fā)疾病可達到 44% 的保護率，同時也降低了復發(fā)的頻率與嚴重程度，產(chǎn)生長效持久的保護作用，但隱患也較多，存在毒力返祖的風險，某些 HSV 基因還存在致癌的可能性[8，9]。
3. 載體疫苗:兼具了減毒活疫苗和亞單位疫苗的優(yōu)點，同時能避免 HSV 的毒性、潛伏性以及致癌性等問題。在免疫接種時，以病毒或細菌作為載體的疫苗表達具有免疫原性的蛋白，并且相關基因編碼產(chǎn)物能誘導廣泛的體液免疫和細胞免疫[10]。
4. DNA 疫苗:主要是將病毒的編碼基因插入到質(zhì)粒 DNA 中，然后直接接種于體內(nèi)。在目前沒有行之有效的疫苗可以和 HSV 病毒相拮抗時，該種疫苗受到了高度重視，它能夠在宿主體內(nèi)表達相應的病毒蛋白從而誘發(fā)多個抗原表位，其中包括不會發(fā)生抗原漂移的保守性抗原表位，在接種宿主體內(nèi)連續(xù)表達多個多肽時，還能模擬減毒活疫苗的效應，直接刺激抗原遞呈細胞，尤其是樹狀突細胞(DC)[11，12]。盡管 DNA 疫苗具有活載體免疫的某些優(yōu)點，能克服由非復制性抗原所誘導的細胞免疫效果較低等難題，但外源基因進入機體內(nèi)會不會與宿主基因發(fā)生整合還有待進一步的研究證實。
5. 復制缺陷病毒疫苗:缺乏對病毒基因組復制、合成以及病毒顆粒裝配必要的一個或多個功能，在正常細胞中由于復制的部分過程受阻并不產(chǎn)生子代病毒，但卻正常表達基因產(chǎn)物，因此可充分利用 MHCⅠ 類和Ⅱ類的抗原遞呈作用，已經(jīng)研發(fā)此類疫苗能夠有效減輕病毒脫落、減少病毒在神經(jīng)節(jié)的裝載量、誘發(fā)病毒特異性 CD8 + T 細胞、有效地保護動物免于急性病毒攻擊，但在臨床中的表現(xiàn)卻不盡如人意，尤其是在Ⅱ期臨床中。
二、存在的問題與展望
面對這樣的局面，哈欽森癌癥研究中心在 2012 年的一個最近的獨特研究認識到一個治療單純性皰疹病毒疫苗失敗的主要原因是當前疫苗策略大多集中在復制病毒、蛋白質(zhì)或 DNA，而未看重根除潛伏的整合性或非復制的附加型病毒基因組。該研究還關注到內(nèi)切酶可以清除隱藏的整合在體內(nèi)的病毒基因組，這些酶被工程化擁有高度精確性，這樣在關鍵位置結(jié)合不會有任何錯誤，而不精確的非同源末端加入 (NHEJ)修復，在重復清除的位置同時進行可以破壞的重要病毒蛋白。同時載有不同的 DNA 清除酶，鋅指內(nèi)切酶，轉(zhuǎn)錄激活樣(TAL)內(nèi)切酶(TALENs)和歸巢內(nèi)切酶的傳遞等都尚在研究之中[13]。同時，另一項研究也密切關注潛伏病毒基因組，他們最近將陽離子油脂抗原(Vaxfectin)在鼠模型中表達 gD2:40% 的小鼠 接 種 這 種 Vaxfectin - gD2pDNA 沒 有 檢 測 到 HSV - 2 病毒基因組。而另一個新關注的策略是細胞介導的對病毒蛋白的反應。許多新研究共同繼續(xù)關注 HSV - 1 的包膜糖蛋白和 HSV - 2 產(chǎn)生的細胞反應。比薩大學最近的一項研究通過貓免疫缺陷病毒(fip)載體用老鼠來測試 gB1 疫苗。疫苗誘導交叉中和抗體激活，以及細胞介導的反應，保護 100% 和 75% 的老鼠不受 HSV - 1 和 HSV - 2 感染[14]。最近瑞典進行的一項研究顯示，糖蛋白 G 結(jié)合輔助 CpG，可能是一個有前途的疫苗抗原。這些小鼠的血清顯示巨噬細胞介導的，抗體依賴性細胞毒性和抗體依賴性補體介導的細胞溶解。這種保護是由脾 CD4 + T 細胞在體外與抗原引發(fā)刺激 γ 干擾素(IFN - γ)響應產(chǎn)生，同時也顯示這種 IFN - γ 反應，這種免疫可以保護 80% ～ 100% 小鼠免受致命的陰道 HSV - 2 侵襲; 它還減少疾病嚴重程度和病毒復制[15]。糖蛋白 B、 C、E、G 的免疫決定性表位肽，gb2466 - 473、gC2216 - 223、gE2483 - 491、gG2572 - 579、gI2286 - 295 和 HSV - 2，分別被證明可以刺激小鼠產(chǎn)生抗體，在體外中和 HSV - 2 [16]。南京醫(yī)科大學研制的 CJ2 - gD2，是一類表達 gD2 的新的復制 - 缺陷型病毒性疫苗，展現(xiàn)了臨床前免疫原性，能夠誘發(fā)強 HSV - 2 - 特異的記憶 CD4 + 和 CD8 + T 細胞反應。gD2 的表達與野生型 HSV - 2 感染的效率相近，能夠使得同時感染 CJ2 - gD2 的細胞，野生型 HSV - 2 病毒復制下降 150 倍，與野生型 HSV - 2 的感染的多樣性相同[17]。另一種更新的方法涉及一個候選疫苗(稱 HerpV)由 32 個合 成 的 35merHSV - 2 肽非共價地與重組人類 Hsc70 蛋白質(zhì)混合組成。這些肽代表 22 個與 HSV - 2 病毒復制有關的蛋白。最近總結(jié)的第一階段研究設有 4 個組: HerpV + 皂素佐劑(QS - 21)、HerpV、 QS - 21、空載。HSV - 2 陽性組參與者注射了 HerpV + QS - 21 后 CD4 + 和 CD8 + T 細胞顯示出很強的對 HSV - 2 抗原反應。HSV - 2 + 參與者可以通過注射肽鏈型疫苗獲得一個廣泛的 CD4 + 和 CD8 + T 細胞反應[18]。這些最新的研究結(jié)果雖然還沒有得到最終的臨床驗證，但還是非常令人鼓舞的。
相關期刊推薦：《中國疫苗和免疫》(雙月刊)創(chuàng)刊于1995年，由中國疾病控制中心(原中國預防醫(yī)學科學院)和衛(wèi)生部疾病控制司聯(lián)合主辦。主要設有：述評、論著、管理、經(jīng)驗交流、短篇報道、綜述、講座、學術報告、學術討論、專家訪談、文摘和信息等欄目。有投稿需求的，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
疫苗的最佳保護需要增強細胞介導的免疫反應和體液免疫來抵抗病毒。幾十年來，在 HSV - 1 和 HSV - 2 疫苗的發(fā)展歷史上，有疫苗研發(fā)進展到Ⅲ期臨床試驗，但結(jié)果卻沒有像在小鼠和其他模式生物身上那么有效，所以未來研究的方向應該是揭示 T 細胞對 HSV 表位的反應規(guī)律。與 此 同 時，動 物 模 型 是 HSV 治療性疫苗研發(fā)的關鍵，目前用于 HSV 研究的動物模型主要有小鼠、兔子和豚鼠，均與人體的免疫體系有著較大的差異，比如小鼠模型是不能模擬人類感染 HSV 并潛伏后的自發(fā)性和周期性復發(fā)疾病，所以才導致了在動物實驗上表現(xiàn)良好的候選疫苗在臨床實驗中遭遇滑鐵盧[19]。因此，建立更加接近人體免疫特征的非人靈長類動物模型也將是開發(fā) HSV 疫苗的重要研究方向。