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摘 要： 摘要：目的 改進(jìn)高效液相色譜方法測(cè)定硫酸奈替米星注射液含量。方法 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (4.6mm250mm, 5m);流動(dòng)相為庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調(diào)pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)205nm;流速1.0m
摘要：目的 改進(jìn)高效液相色譜方法測(cè)定硫酸奈替米星注射液含量。方法 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (4.6mm×250mm, 5μm);流動(dòng)相為庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調(diào)pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)205nm;流速1.0mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量20μL。結(jié)果 硫酸奈替米星濃度在0.1~1.0mg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為1.0000;平均回收率為98.3%，RSD為0.5%(n=9)。改進(jìn)方法與微生物檢定法所測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便快捷、專(zhuān)屬性強(qiáng)、線性范圍寬，精密度和準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，該方法可等效替代抗生素微生物檢定法用于硫酸奈替米星注射液的含量測(cè)定。
關(guān)鍵詞：硫酸奈替米星;高效液相色譜;抗生素微生物檢定;等效替代
奈替米星是以西索米星為起始原料的半合成氨基糖苷類(lèi)抗生素，系廣譜殺菌抗生素，其生物利用度高，毒性較同類(lèi)抗生素小，耐受性好，臨床療效高，在細(xì)菌感染方面具有較好的治療作用[1-2]。目前中國(guó)藥典、歐洲藥典及日本藥局方均采用抗生素微生物檢定法測(cè)定硫酸奈替米星及相關(guān)制劑的含量。該方法雖然能直觀反映含量與抗菌能力的關(guān)系，因?yàn)榇嬖诓僮髻M(fèi)時(shí)、專(zhuān)屬性差、對(duì)操作人員要求高且易產(chǎn)生諸多操作誤差等缺點(diǎn)，所以高效液相色譜法已成為抗生素含量測(cè)定的主流[3]。美國(guó)藥典收載方法為高效液相色譜法，其流動(dòng)相中含有高濃度離子對(duì)試劑，存在色譜系統(tǒng)平衡慢、檢驗(yàn)成本高、對(duì)色譜柱傷害嚴(yán)重且分離能力差等問(wèn)題[4-5]。為有效解決上述問(wèn)題，本文對(duì)高效液相色譜條件進(jìn)行了改進(jìn)，使用低濃度的離子對(duì)試劑即能達(dá)到有效分離，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便易行。
1 儀器與試劑
1.1 儀器
Shimadzu高效液相色譜儀(LC-20AB泵、DGU- 20A3R在線脫氣機(jī)，SIL-20ACHT自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO- 20AC柱溫箱，SPD-M20A紫外檢測(cè)器)，Mettler Toledo XS205電子天平，色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm, 5μm)，Millipore去離子水發(fā)生裝置。
1.2 試藥
奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130355-200702，577U/mg)，西索米星對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130635- 201301，56.0%)，奈替米星對(duì)照品(USP對(duì)照品，批號(hào)：1460500，110℃減壓干燥至少3h，以干燥品計(jì)為65.5%)，乙腈為色譜級(jí)(默克股份兩合公司)，庚烷磺酸鈉(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，硫酸奈替米星注射液[64批次，規(guī)格為1mL:5萬(wàn)單位(相當(dāng)于50mg) 和2mL:10萬(wàn)單位(相當(dāng)于100mg)]分別由國(guó)內(nèi)A、B、 C、D、E、F、G、H、I和J廠家提供，硫酸奈替米星原料(批號(hào)：01-05013-151103)由國(guó)內(nèi)K廠家提供。
2 含量測(cè)定方法的建立
2.1 色譜條件
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm, 5μm);流動(dòng)相：庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調(diào) pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量為20μL。系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中西索米星峰與奈替米星峰間分離度不低于3.0，奈替米星峰與其相對(duì)保留時(shí)間1.1倍雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求，連續(xù)進(jìn)樣6針，奈替米星峰面積的RSD不大于1.0%。
2.2 溶液的配制
流動(dòng)相：庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調(diào)pH至 2.5)-乙腈(77:23, V/V)。系統(tǒng)適用性溶液：取奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品和西索米星對(duì)照品各約22mg，精密稱(chēng)定，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品約22mg，精密稱(chēng)定，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。
供試品溶液：取硫酸奈替米星注射液1.00mL至 50mL容量瓶中，加水定容至刻度后搖勻，取5.00mL 至20mL，搖勻即得。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
按“2.1”項(xiàng)條件，精密量取“2.2”項(xiàng)下各溶液 20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：空白溶劑基線平穩(wěn)，各輔料對(duì)硫酸奈替米星含量測(cè)定無(wú)干擾。西索米星的保留時(shí)間約為10.4min，奈替米星的保留時(shí)間約為12.9min，西索米星峰與奈替米星峰間分離度為5.2，奈替米星峰與其1.1倍保留時(shí)間峰的分離度為1.8，以奈替米星峰計(jì)理論板數(shù)為10777，系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，奈替米星峰面積RSD為0.5%，符合HPLC定量分析的要求，典型色譜圖見(jiàn)圖1。
2.4 色譜柱的選擇
選取Phenomenex-Gemini-NX C18、WatersXBridge Shield RP18及Agilent ZORBAX SB-C18 3個(gè)常用品牌的色譜柱，進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察的典型色譜見(jiàn)圖2，西索米星峰與奈替米星峰，奈替米星峰與后相鄰峰的分離度見(jiàn)表1。
結(jié)果表明：3款色譜柱均符合美國(guó)藥典的要求，其中兩款符合新建色譜系統(tǒng)適用性要求，說(shuō)明本方法對(duì)色譜柱的耐用性比較好。
2.5 線性與范圍
取奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱(chēng)定，加水溶解并稀釋制成0.1，0.2，0.25，0.5及1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各溶液的濃度(mg/mL) 為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制回歸曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)及回歸方程，所得線性回歸方程為Y=7838562X+24536(r=1.0000)。結(jié)果表明硫酸奈替米星濃度在0.1~1.0mg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。
2.6 檢測(cè)限與定量限
取線性項(xiàng)下濃度為0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)系列稀釋后進(jìn)樣檢測(cè)，按信噪比約為3計(jì)算，奈替米星的檢測(cè)限為20ng，按信噪比約為10計(jì)算，奈替米星的定量限為40ng。結(jié)果表明：該方法靈敏度高。
2.7 重復(fù)性
取A廠家批號(hào)為1511076的硫酸奈替米星注射液6 份，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算含量，所測(cè)含量RSD為0.20%(n=6)，表明該方法重現(xiàn)性良好，各樣品含量見(jiàn)表2。
2.8 回收率試驗(yàn)
精密稱(chēng)定奈替米星(批號(hào)：01-05013-151103)12.5mg兩份，分別置于50mL量瓶中，加水溶解，用水稀釋至刻度，測(cè)定其含量。根據(jù)廠家處方工藝，分別稱(chēng)取EDTA-二鈉、檸檬酸鈉、L-半胱氨酸與硫酸奈替米星適量，按制劑處方量配制硫酸奈替米星注射液空白輔料母液。另取奈替米星(批號(hào)：01-05013- 151103)10、12.5及15.625mg各3份，分別置于50mL 量瓶中，分別加入相應(yīng)處方量的輔料母液，加水溶解，用水稀釋至刻度，作為回收率供試品溶液，分別精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。
按處方量配制3個(gè)濃度水平的9份硫酸奈替米星溶液，記錄所得色譜圖峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量和回收率。平均回收率為98.51%，RSD為0.5% (n=9)，結(jié)果表明：本方法回收率良好，準(zhǔn)確度較高，各濃度樣品含量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。
2.9 溶液穩(wěn)定性
精密稱(chēng)定奈替米星原料(批號(hào)：01-05013- 151103)12.5mg，置于50mL量瓶中，加水溶解，用水稀釋至刻度，分別在0、2、4、6、8和10h時(shí)，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣品含量的RSD。結(jié)果表明：各時(shí)間點(diǎn)含量的RSD為0.2%(n=6)，結(jié)果表明溶液至少在10h 內(nèi)的穩(wěn)定性是良好的。
2.10 小結(jié)
改進(jìn)的高效液相色譜法測(cè)定硫酸奈替米星含量具有操作簡(jiǎn)便快捷、專(zhuān)屬性強(qiáng)、線性范圍寬，精密度和準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
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3 液相色譜測(cè)定方法與抗生素微生物檢定方法的等效替代可行性考察
3.1 中檢院硫酸奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品與美國(guó)藥典(USP)硫酸奈替米星對(duì)照品轉(zhuǎn)換系數(shù)的確定
由于中國(guó)藥典和歐洲藥典規(guī)定的含量測(cè)定方法均為抗生素微生物檢定法(效價(jià)法)，因此中檢院的標(biāo)準(zhǔn)品和歐洲藥典的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示的含量均為效價(jià)值，中檢院標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示含量為577IU/mg，歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示含量為14656IU/瓶。USP標(biāo)準(zhǔn)為液相紫外測(cè)定方法，其對(duì)照品每瓶為500mg，為濕品，干燥條件：110℃減壓干燥至少3h，標(biāo)示含量：以干燥品計(jì)為65.5%。我們以卡爾費(fèi)休氏法測(cè)定了USP對(duì)照品的水分為11.99%，將USP濕品對(duì)照品含量直接折算為 57.65%，然后以USP對(duì)照品濕品為對(duì)照品測(cè)定中檢院標(biāo)準(zhǔn)品含量為56.9%。計(jì)算出純品效價(jià)和絕對(duì)含量之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)F(IU/mg)為1.014。
3.2 含量測(cè)定及量效轉(zhuǎn)換后結(jié)果與效價(jià)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
以中檢院標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下方法對(duì)來(lái)自10個(gè)廠家的64批次硫酸奈替米星注射液進(jìn)行含量測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果表明，64批次樣品均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。同一樣品由HPLC測(cè)得結(jié)果的 RSD較抗生素微生物檢定法測(cè)得結(jié)果的RSD低，表明HPLC方法的精密度優(yōu)于微生物檢定法。
將高效液相色譜法測(cè)得的含量乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)F，計(jì)算出樣品的標(biāo)示含量，然后以該標(biāo)示含量與微生物效價(jià)法測(cè)定的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS軟件將兩種方法所測(cè)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法所得結(jié)果差異不顯著(P=0.15>0.05)。說(shuō)明兩種含量測(cè)定方法有替代的可能。
3.3 量效統(tǒng)一性考察
根據(jù)USP通則1223.1中替代抗生素微生物檢定法的驗(yàn)證要求，本實(shí)驗(yàn)以USP硫酸奈替米星對(duì)照品為對(duì)照，按照建立的高效液相色譜法標(biāo)化中檢院標(biāo)準(zhǔn)品含量，計(jì)算純品效價(jià)和絕對(duì)含量之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)F。以中檢院標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，測(cè)定樣品的標(biāo)示含量，乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)得到量效轉(zhuǎn)換后效價(jià)含量。將量效轉(zhuǎn)換后效價(jià)含量與微生物法測(cè)定的效價(jià)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，結(jié)果符合Ep.2[-kMicro