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摘 要： [摘 要]目的: 建立一種快速、準確的超高效液相色譜串聯質譜法( UPLC-MS /MS) ，用于臨床上測定人血清中氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齊拉西酮 5 種常用的非典型抗精神病藥物的血藥濃度。方法: 以氯氮平-d3、喹硫平-d8、阿立哌唑-d8 和齊拉西酮
[摘 要]目的: 建立一種快速、準確的超高效液相色譜串聯質譜法( UPLC-MS /MS) ，用于臨床上測定人血清中氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齊拉西酮 5 種常用的非典型抗精神病藥物的血藥濃度。方法: 以氯氮平-d3、喹硫平-d8、阿立哌唑-d8 和齊拉西酮-d8 穩定同位素為內標，血清樣品經過前處理后采用 UPLCMS /MS 對上清液進行分析。結果: 空白血清對藥物的檢測無干擾，氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齊拉西酮在 1. 00 ～ 1 000 μg /L 范圍內線性良好，相關系數 r > 0. 998 8; 日內、日間精密度( RSD) 均小于 15% ，回收率 90% ～ 110% ; 樣品在室溫 12 h、4 ℃冰箱 48 h、自動進樣器 24 h 及反復凍融 3 次的情況下都能保持穩定。結論: 本方法前處理操作簡單，能夠快速、準確、高通量地檢測所選擇的 5 種非典型抗精神病藥物的血藥濃度。
[關鍵詞]超高效液相串聯質譜; 血藥濃度; 非典型抗精神病藥物; 血清; 同位素內標
治 療 藥 物 監 測 ( therapeutic drug monitoring， TDM) 是運用現代分析技術，測定血液或其他體液中的藥物及其代謝物的濃度，并根據藥動學和藥效學理論分析并制定最佳給藥方案，從而達到安全合理用藥的目的[1 - 4]。精神分裂癥是一種病因復雜，與中樞神經系統病變有關的疾病，長期應用抗精神病類藥物治療可能產生嚴重的錐體外系癥狀 ( EPSs) ，目前非典型抗精神病藥已經成為主要的抗精神病藥物[5 - 9]。因此，對于抗精神病類藥物而言，測定血漿或血清中藥物濃度實現個體化給藥，能夠獲得最佳的療效、更好的耐受性，同時還可以降低中毒的風險[10]，為達到這一目的，本研究參考文獻[11 - 14]，采用超高效液相串聯質譜法( UPLC -MS /MS) 同時檢測 5 種非典型抗精神病類藥物的血藥濃度，報告如下。
1 材料與方法
1. 1 儀器
Waters Acquity UPLC-TQ-D 型液質聯用儀( 美國，Waters 公司) ，H1650R 臺式高速冷凍離心機 ( 中國，上海盧湘儀離心機儀器有限公司) ，BT125D 電子天平( 德國，賽多利斯股份公司) ，G560E 渦旋混合器( 美國，Scientific Industries 公司) 。
1. 2 試藥
氯氮平購自 Sigma( 美國) ，阿立哌唑購自中國食品藥品檢定研究院，喹硫平、齊拉西酮、氯氮平- d3、喹硫平-d8 和齊拉西酮-d8 購自 Toronto research chemicals Inc( 加拿大) ，N-去甲基氯氮平、阿立哌唑-d8 購自 cerilliant( 美國) ，色譜甲醇、乙腈購自默克公司( 德國) ，屈臣氏蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。
1. 3 色譜及質譜條件
1. 3. 1 色譜條件 色譜柱 Acquity UPLC BEH C18 IVD ( 2. 1 mm ×50 mm，1. 7 μm) ，柱溫50 ℃，進樣量 5 μL，流速 0. 5 mL /min。流動相: 0. 1% 甲酸水溶液 ( A) ，0. 1% 甲酸甲醇溶液 ( B) ，梯度洗脫，0 ～ 0. 5 min 使用 20% B，0. 5 ～ 1. 3 min 使用 20% ～ 80% B，1. 3 ～ 1. 7 min 使用 80% ～ 95% B，1. 7 ～ 1. 75 min 使用 95% ～ 20% B; 1. 75 ～ 2. 0 min 使用 20% B。 +
1. 3. 2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子模式; 毛細管電壓 3. 0 kV，脫溶劑氣溫度( TEM) 500 ℃，脫溶劑氣流( L /Hr) 800，錐孔氣流( L /Hr) 50，掃描模式為多反應監測( MRM) 。常見非典型抗精神病藥物質譜參數見表 1。
1. 4 樣品處理及標準液的配制
1. 4. 1 樣品處理 取血清樣品 100 μL 置 1. 5 mL EP 管中，加入 400 μL 內標溶液，渦旋混合 3 min，于 4 ℃ 11 000 r/min 離心 15 min; 取 300 μL 上清液置于另一個 1. 5 mL EP 中，4 ℃ 11 000 r/min 離心 15 min，取 100 μL 上清液置于 96 孔板中，進樣 5 μL進行分析。
1. 4. 2 標準溶液的配制 精密稱取各標準品 10 mg分別置于 10 mL 量瓶中，用純甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為 1. 0 g /L 的標準溶液儲備液。將各標準溶液儲備液用甲醇稀釋 10 倍得到濃度為 100 mg /L 的各標準溶液工作液，分別吸取各標準溶液工作液 100 μL 置 1. 5 mL 的 EP 管中，渦旋混勻，得到濃度為 10 mg /L 的混合標準溶液; 用空白血清稀釋成濃度分別為 1 000、500、250、100、 50、25、10、5、2. 5 及 1 μg /L 的基質標準曲線。內標的配制: 將濃度為 100 mg /L 的內標溶液儲備液用甲醇稀釋成濃度為 25 μg /L 的內標工作液，保存于 - 80 ℃冰箱。
1. 5 統計學方法
數據處理采用 MassLynx V4. 2 軟件，數據分析采用 Excel 軟件計算均值( x) 、標準偏差( S) 和相對標準偏差( RSD% ) ，數據結果采用( x ± s) 表示，日內、日間精密度用 RSD% 進行評價。
2 結果
2. 1 線性和定量下限考察
按照 1. 4. 2 項下步驟配制基質標準曲線及1. 4. 1 項下操作對基質標準曲線進行處理，以各藥物的濃度為橫坐標，以各藥物峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標進行線性回歸，計算回歸方程; 同時，用空白血清配制濃度為 1. 0 μg /L 的各藥物的定量下限樣品。結果表明，各藥物在線性范圍內線性良好，各藥物的線性范圍和線性方程及相關系數見表 2; 各藥物在定量下限 1. 0 μg /L 處的響應良好( 見圖 1) ，精密度小于 15% ( 見表 3) 。
2. 2 日內、日間精密度和回收率
用空白血清制備低、中、高濃度的質控樣品，每個濃度質控樣品取 6 份測定作為日內精密度，連續檢測 3 天獲得的結果作為日間精密度。向空白血清中加入低、中、高濃度的標準品，每個濃度各取 6 份，通過計算檢測值與加入的標準品的比值，取平均值得到回收率。結果表明，各藥物的日內、日間精密度( RSD% ) 均 小于 15% ; 平均回收率在 90% ～ 110% 。見表 4。
2. 3 穩定性
用空白血清制備低、高濃度的質控樣品，每個濃度各取 6 份，考察各藥物低、高兩個濃度在室溫、 4 ℃冰箱、自動進樣器以及 3 次反復凍融時的穩定性。室溫考察的時間點包括 0、8 及 12 h，4 ℃ 冰箱考察的時間點包括 0、12、24 及 48 h，自動進樣器考察的時間點包括 0 及 24 h。結果表明，各藥物在考察的條件下均保持穩定。見表 5。
3 討論
精神疾病是近年來多發的病因不明的疾病之一，精神疾病患者給家庭帶來很大的經濟壓力和心理壓力，已經越來越受到醫護人員和相關人員的極大關注。傳統治療藥物監測技術，例如基于光譜學、免疫抗體學等臨床檢測技術，具有定性定量特征信息單一的弱點，抗干擾能力差; 目前國內對抗精神類藥物進行的血藥濃度監測主要運用反相高效液相色譜法[15 - 17]，在靈敏度、特異性和準確性方面與液質聯用( LC-MS /MS) 法存在較大差距，且前處理過程復雜、分析時間過長[18 - 20]。LC-MS /MS 具有更高的靈敏度和特異性，并且可以實現多組分同時分析，具有更高的檢測通量，在臨床檢測中表現出較大的優勢[21]。本文建立 LC-MS /MS 方法中各藥物在 1. 0 ～ 100 0 μg /L 范圍內線性良好，相關系數( r) 均大于 0. 998 8; 各藥物在定量下限 1. 0 μg / L 處的響應良好，精密度小于 15% ; 日內、日間精密度均小于 15% ; 平均回收率在 90% ～ 110% ，樣品穩定性良好。楊春霞[17]等的研究中前處理步驟采用乙醚萃取，再將乙醚真空揮干后復溶，操作復雜，本研究前處理過程僅需甲醇蛋白沉淀一個步驟，大大簡化了前處理過程; Dongeun Park 等[11]的研究中液相分離時間為 11 min，本研究中將時間縮短到 2 min，大大縮短檢測時間; 同時本研究使用穩定同位素內標，確保檢測結果的準確性。因此，與國內外已有的方法相比本研究的方法在前處理過程，檢測時間和準確性等方面都有明顯優勢
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