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摘 要： 摘要背景：補(bǔ)骨脂素是屬于植物類雌激素，有大量研究證實(shí)其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用。目的：應(yīng)用補(bǔ)骨脂素、兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞和聚己內(nèi)酯支架構(gòu)建人工復(fù)合骨，探討其治療兔骨不連的效果。方法：①將第3代兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加
摘要背景：補(bǔ)骨脂素是屬于植物類雌激素，有大量研究證實(shí)其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用。目的：應(yīng)用補(bǔ)骨脂素、兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞和聚己內(nèi)酯支架構(gòu)建人工復(fù)合骨，探討其治療兔骨不連的效果。方法：①將第3代兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入10-8，10-7，10-6mol/L補(bǔ)骨脂素、50mg/L骨形態(tài)發(fā)生蛋白2進(jìn)行干預(yù)，對照組加入同體積的無菌純凈水。干預(yù)第3，5，7天采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況;②將聚己內(nèi)酯三維支架加入到細(xì)胞培養(yǎng)板底部，兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞按1×103/孔的量接種于支架上，然后加入10-6mol/L補(bǔ)骨脂素，聯(lián)合培養(yǎng)21d后取出即為人工復(fù)合骨;③27只新西蘭大白兔隨機(jī)均分為3組，建立橈骨骨不連模型，實(shí)驗(yàn)組植入人工復(fù)合骨，支架組單純植入支架，對照組不植入任何材料。術(shù)后2，4，8周行病理學(xué)蘇木精-伊紅染色，觀察成骨情況。術(shù)后第4周拍攝X射線片，觀察骨不連愈合情況。結(jié)果與結(jié)論：①3種濃度補(bǔ)骨脂素均有誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用，與對照組比較，10-6mol/L補(bǔ)骨脂素對兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞刺激作用最強(qiáng)(P<0.05)，而且10-6mol/L補(bǔ)骨脂素組與陽性對照骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組相比差異無顯著性意義(P>0.05);②新西蘭大白兔橈骨中段骨不連組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞數(shù)目明顯多于支架組和對照組(P<0.05);③X射線片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組骨不連已經(jīng)愈合，支架組骨折部分愈合，對照組骨不連未愈合;④結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素對兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用與濃度有一定的相關(guān)性。補(bǔ)骨脂素可結(jié)合兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞及聚己內(nèi)酯支架形成人工復(fù)合骨，通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其治療骨不連效果較好。
關(guān)鍵詞：補(bǔ)骨脂素;兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞支架;骨不連
0引言Introduction
骨不連在臨床實(shí)際工作中比較常見，其治療主要包括物理療法、生物療法和手術(shù)治療。物理療法包括體外沖擊波治療、低頻脈沖治療、電刺激療法等;生物療法包括骨生長因子治療、骨髓和干細(xì)胞移植治療、骨組織工程治療;手術(shù)治療包括骨移植、內(nèi)固定治療、外固定治療等。越來越多學(xué)者認(rèn)為骨組織工程治療骨不連是醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢，并且有獨(dú)特的效果。
補(bǔ)骨脂素來源于豆科植物補(bǔ)骨脂，是一種植物類雌激素，有研究表明補(bǔ)骨脂素對細(xì)胞增殖有一定的功效[1]。聚己內(nèi)酯是一種生物相容性良好并可被機(jī)體吸收的生物材料，受到研究學(xué)者的廣泛重視[2]。兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離自骨膜，是一種有自我更新和分化能力的骨膜細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增后植入聚己內(nèi)酯三維支架中構(gòu)建人工復(fù)合骨，探討人工復(fù)合骨對兔骨不連的治療效果，為補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并運(yùn)用于骨組織工程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設(shè)計(jì)細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)和隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)。
1.2時間及地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)于2018年6至12月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室完成。
1.3材料補(bǔ)骨脂素(上海士鋒生物科技有限公司);胰蛋白酶(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司);兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma，美國);二甲基亞砜(北京百奧萊博科技有限公司);DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco，美國);聚己內(nèi)酯三維支架(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司);抗壞血酸、地塞米松(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國);自動酶標(biāo)分析儀(北京科瑞美科技有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)板(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司);超凈工作臺(北京佳源興業(yè)科技有限公司)。
實(shí)驗(yàn)動物：新西蘭大白兔27只，體質(zhì)量約1.5kg，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK(粵)2018-0149。
1.4實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞購買自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司，購買后接種于含DMEM-F12培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，每3d換液1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，當(dāng)細(xì)胞增殖到鋪滿培養(yǎng)皿底部時，即用0.25%胰蛋白酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng)，第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4.2補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖將第3代兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×103/孔。實(shí)驗(yàn)分5組，每組5個復(fù)孔，分別為補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組(10-8，10-7，10-6mol/L)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組、對照組。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組僅加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(50mg/L)，對照組加入同體積的無菌純凈水。干預(yù)第3，5，7天檢測吸光度值，簡略步驟：加入MTT(5g/L)20µL，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，加入0.15mL二甲基亞砜，結(jié)晶溶解后檢測各組吸光度值，每次重復(fù)檢測3次，取均值。
1.4.3兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞與聚己內(nèi)酯三維支架構(gòu)建人工復(fù)合骨將兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞以1×107L-1細(xì)胞濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，然后將聚己內(nèi)酯三維支架放于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，加入含有10-6mol/L補(bǔ)骨脂素的DMEM-F12培養(yǎng)液，每3d更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，第14天取出細(xì)胞支架復(fù)合物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4.4動物骨不連模型的建立及人工復(fù)合骨的植入取27只1.5kg左右的新西蘭大白兔，隨機(jī)分為3組，每組9只。首先刮除下肢毛發(fā)，戊巴比妥鈉麻醉至大白兔活動無力，用手術(shù)刀分離右前肢橈骨中段的皮膚組織，暴露出骨質(zhì)后，剪除一整段約1.5cm的骨質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組植入人工復(fù)合骨，支架組單純植入聚己內(nèi)酯三維支架，對照組無植入物，術(shù)后在同一飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)。
1.4.5蘇木精-伊紅染色術(shù)后第2，4，8周，各組分別處死3只新西蘭大白兔，剔除毛發(fā)，切開皮膚，分離暴露骨不連處骨質(zhì)，截取0.8cm組織塊，先用40g/L多聚甲醛浸潤，然后用脫鈣液和乙醇分別處理，脫去鈣質(zhì)和水分，石蠟包埋后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞數(shù)量[3]。
1.4.6X射線攝片檢測骨不連術(shù)后第4周，處死之前用X射線機(jī)拍片檢測骨不連愈合情況(型號：warianRAD-14)，拍片設(shè)定為：管電流80mA，管電壓50kV，焦距90cm，曝光時間0.3s。
1.5主要觀察指標(biāo)①兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖情況;②骨不連處病理切片形態(tài)和成骨細(xì)胞計(jì)數(shù);③骨不連處大體X射線片觀察骨愈合情況。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件用SPSS17.0，數(shù)據(jù)以x_±s表示，組內(nèi)比較采用方差分析，組間差異用最小顯著差異法(LSD法)，P<0.05為差異有顯著性意義。
2結(jié)果Results
2.1兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖情況各組兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖見表1，圖1。各組吸光度值總體均隨時間延長而增加，以第7天吸光度值最大。與對照組相比，不同濃度補(bǔ)骨脂素組及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組各時間點(diǎn)吸光度值均升高(P<0.05);與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組相比，補(bǔ)骨脂素高濃度組吸光度值差異無顯著性意義(P>0.05)，補(bǔ)骨脂素中濃度組及補(bǔ)骨脂素低濃度組吸光度值均小于骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組(P<0.05)。
2.2實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析
27只新西蘭大白兔參加實(shí)驗(yàn)，中途無脫落，均進(jìn)入結(jié)果分析。
2.3蘇木精-伊紅染色切片成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)情況各組切片蘇木精-伊紅染色后成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)見表2，圖2。支架組及實(shí)驗(yàn)組在第2，4，8周成骨細(xì)胞逐漸增多，對照組僅第4周有所增多，第8周比第4周減少。與對照組相比，支架組和實(shí)驗(yàn)組在各個時間點(diǎn)成骨細(xì)胞數(shù)量均增多(P<0.05);與支架組相比，實(shí)驗(yàn)組在各個時間點(diǎn)成骨細(xì)胞數(shù)量均增多(P<0.05)。
2.4各組橈骨中段骨不連組織病理形態(tài)術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組見大量新生的骨質(zhì)，呈編織樣，少量微血管，骨細(xì)胞散在各處骨質(zhì)端，見圖3A;支架組新生骨及骨細(xì)胞比實(shí)驗(yàn)組少，有比較多的細(xì)血管，骨折端不完全被骨質(zhì)代替，見圖3B;對照組顯微鏡下可見大量的細(xì)小血管和肉芽組織，骨細(xì)胞少，有多處鈣化點(diǎn)，見圖3C。
2.5各組術(shù)后4周影像學(xué)觀察骨愈合情況實(shí)驗(yàn)組骨不連已經(jīng)愈合，未見骨折線，骨皮質(zhì)致密，骨髓腔已經(jīng)貫通，骨小梁呈網(wǎng)格狀排列，見圖4A;支架組骨皮質(zhì)未完全相連，髓腔部分貫通，骨折部分愈合，骨小梁存在，見圖4B;對照組骨不連未愈合，骨間隙清晰存在，見圖4C。
3討論Discussion
豆科植物提取物補(bǔ)骨脂素用于骨組織工程的研究較少，以往研究骨組織工程治療骨不連常常選用注射成骨因子、植入自體骨髓等方法，該研究體外培養(yǎng)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，用聚己內(nèi)酯支架為載體，補(bǔ)骨脂素為誘導(dǎo)刺激劑，成功構(gòu)建了內(nèi)含活細(xì)胞的復(fù)合人工骨。實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)的動物骨不連模型，植入復(fù)合人工骨后通過切片和影像學(xué)觀察其實(shí)際效果，為補(bǔ)骨脂素運(yùn)用于骨組織工程提供一種新的思路。
補(bǔ)骨脂素提取自補(bǔ)骨脂、珊瑚菜、蕓香等植物，屬于香豆素類，是一種植物雌激素，有多種生物活性作用，如抗骨質(zhì)疏松、抗白血病、抗子宮出血、抗哮喘、治療骨折、促進(jìn)細(xì)胞增殖等[4-5]。多位學(xué)者證實(shí)，補(bǔ)骨脂素有抗骨質(zhì)疏松的作用[6-8]，黃奎等[9]建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，采用補(bǔ)骨脂素灌胃，并通過鉬靶X射線及生物力學(xué)等方法證實(shí)補(bǔ)骨脂素能有效改善骨折愈合質(zhì)量和生物學(xué)功能。楊伊姝等[10]建立了大鼠強(qiáng)迫游泳及懸尾等抑郁模型，用不同劑量的補(bǔ)骨脂素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素有抗抑郁的效應(yīng)。還有研究建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素能影響Notch信號通路，從而有抗骨質(zhì)疏松的作用[11]。李少鵬等[12]采用CCK-8、Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)等方法證實(shí)補(bǔ)骨脂素對前列腺癌細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性，說明補(bǔ)骨脂素有抗腫瘤作用。霍力為等[13]從乳鼠頭蓋骨獲得骨細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素對乙醇誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞有明顯的促增殖功效。另外還有研究認(rèn)為補(bǔ)骨脂素有抑制成骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的功能[14-17]。
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細(xì)胞支架要滿足多個條件[18-19]：①機(jī)體能耐受，無毒性，有良好生物相容性;②可被機(jī)體自然降解，并且降解后能被機(jī)體吸收;③有合適細(xì)胞增殖的三維空間;④有良好的可塑性，能塑形為不同的形態(tài)結(jié)構(gòu);⑤支架表面和細(xì)胞膜能有效接觸，細(xì)胞可有效附著在上面。目前組織工程支架包括生物類、異種材料類、人工復(fù)合物類。生物類取材機(jī)體自身，如自體髂骨，無免疫排斥性，但對機(jī)體有明顯的損傷，且無法大量獲得;異種材料類包括膠原海藻、羥基磷灰石等，但有生物相容性差、無法降解、免疫排斥等缺點(diǎn);聚己內(nèi)酯細(xì)胞支架有可吸收降解、能塑形、細(xì)胞容易在內(nèi)增殖等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程中有潛力的一種支架材料[2，20]。課題組通過補(bǔ)骨脂素持續(xù)刺激聚己內(nèi)酯支架中的兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，成功構(gòu)建了人工復(fù)合骨，并通過動物模型驗(yàn)證其性能，蘇木精-伊紅染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組見大量新生的骨質(zhì)，呈編織樣，少量微血管，骨細(xì)胞散在各處骨質(zhì)端，而純支架組無論是骨質(zhì)礦化，還是骨細(xì)胞數(shù)量均較少。說明該人工復(fù)合骨治療骨不連，能夠縮短骨愈合時間，提高成骨質(zhì)量，同時也說明補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖是有效獲得骨組織工程種子細(xì)胞的方案。通過X射線攝片，進(jìn)一步證實(shí)了組織學(xué)的結(jié)論，術(shù)后4周復(fù)合骨能完全治愈骨不連，而支架組只能使部分骨缺損愈合。
兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞一般分離自四肢管狀骨的骨內(nèi)膜，骨內(nèi)膜是一層組織膜，含有成骨細(xì)胞前體細(xì)胞、血管、神經(jīng)、結(jié)締組織等，是修復(fù)骨重要的解剖結(jié)構(gòu)[21-23]。骨內(nèi)膜內(nèi)的間質(zhì)干細(xì)胞有高度增殖、分化和更新的能力，可向骨及軟骨定向分化，因此可作為良好的種子細(xì)胞。補(bǔ)骨脂素是一種植物類雌激素，因其對成骨細(xì)胞、癌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均有影響而被越來越多的學(xué)者關(guān)注[24-25]。
實(shí)驗(yàn)用補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)10-6mol/L補(bǔ)骨脂素組骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的吸光度值最高，說明10-6mol/L補(bǔ)骨脂素有最大的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中有明確誘導(dǎo)成骨作用的因子[26-27]，實(shí)驗(yàn)選用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2作為陽性對照物進(jìn)一步說明了補(bǔ)骨脂素對細(xì)胞的促進(jìn)分化作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素組與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2組細(xì)胞吸光度值差異無顯著性意義，說明10-6mol/L補(bǔ)骨脂素具有和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2同等效力的促進(jìn)骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)。
應(yīng)用補(bǔ)骨脂素、兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞和聚己內(nèi)酯三維支架構(gòu)建人工復(fù)合骨，并通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可治愈骨不連。補(bǔ)骨脂素對骨膜細(xì)胞的作用機(jī)制可能與植物類雌激素類似，其作用機(jī)制可能和細(xì)胞表面雌激素受體及MAPK通路相關(guān)[28-29]，但其詳細(xì)機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。