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摘 要： 摘要：目的觀察姜黃素對(duì)氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖的影響，并探討血紅素氧合酶一1(HO一1)在姜黃素抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制。方法體外分離培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞并行免疫組化鑒定，以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法
摘要：目的觀察姜黃素對(duì)氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖的影響，并探討血紅素氧合酶一1(HO一1)在姜黃素抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制。方法體外分離培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞并行免疫組化鑒定，以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖率、逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)檢測(cè)HO一1mRNA水平，蛋白免疫印跡法(Westernblot)分別檢測(cè)HO-1及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果0IDL呈濃度依賴性(0～150“g/mL)地誘導(dǎo)VSMC增殖，達(dá)到200/~g/mL具有細(xì)胞毒性;姜黃素呈濃度依賴性(40、80~mol/L)地抑制Ox-LDL(100“g/mL)所誘導(dǎo)的VSMC增殖，HO-1抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)可明顯減弱此抑制效應(yīng);姜黃素可誘導(dǎo)VSMC上調(diào)HO-1mRNA和蛋白表達(dá);姜黃素可減弱Ox-LDL誘導(dǎo)VsMcs增殖細(xì)胞核抗原的高表達(dá)，此效應(yīng)可被H0—1抑制劑ZnPPIX抑制。結(jié)論姜黃素通過(guò)降低HO-1介導(dǎo)的PCNA表達(dá)，進(jìn)而抑制0LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌增殖。
關(guān)鍵詞：姜黃素;氧合酶類;脂蛋白類，LDL
動(dòng)脈樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生機(jī)制十/寸復(fù)雜，q前研究表明氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipo—protein，Ox-LDL)及血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VsMc)增殖是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要病理基礎(chǔ)¨1J。姜黃素是從姜黃、郁金、莪術(shù)等植物中提取的一種生物多酚化合物，研究顯示姜黃素具有抗炎、抗氧化、促細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖等藥理作用，這些作用可有效拮抗AS的發(fā)生與發(fā)展。血紅素氧合酶一l(hemeoxygenase一1，HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶，發(fā)揮著抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡和改善組織微循環(huán)作用，動(dòng)物研究已經(jīng)證明過(guò)表達(dá)HO-1可以明顯延緩As進(jìn)展|2]，但是姜黃素抗AS的相關(guān)機(jī)制還不甚清楚。本研究旨在于細(xì)胞水平探討姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制，為其藥理作用提供理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibico公司;姜黃素、鋅原卟啉IX(zineprotoporphyrinⅨ，zn—PPIX)購(gòu)自Sigma公司;Ox-LDL購(gòu)于北京普博斯生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)試劑均購(gòu)自美國(guó)1n一vitrogen公司;一抗、二抗均購(gòu)于美國(guó)SantaCruz公司;SD大鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;其余實(shí)驗(yàn)相關(guān)產(chǎn)品購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組按常規(guī)組織貼塊方法_3原代培養(yǎng)并傳代，取用第3～8代細(xì)胞。免疫組化法鑒定血管平滑肌細(xì)胞。血管平滑肌細(xì)胞用含1O%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5C02下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：(1)正常對(duì)照組：不加任何處理;(2)不同終濃度Ox-LDL刺激組(0、50、100、150、200、250/~g/mL);(3)不同終濃度姜黃素組(O、2o、4O、80ttmol/L);(4)不同終濃度姜黃素組(0、20、40、80/~mol/L)+Ox-LDL(100/~g/mL)組;(5)Ox-LDL(100/,g/mL)+姜黃素組;(6)姜黃素+ZnPPlX+Ox-IDL(100“g/mI)組。
1.2.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)H0—1mRNA按Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA。取細(xì)胞RNA1“L根據(jù)試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HO-1：上游5GGGT—GACAGAAGAGGCTAAGACC3，下游5AGATTCTC—CCCTGCAGAGAGAAG3。擴(kuò)增條件：94℃變性30s，56℃退火30S，72℃延伸45S，循環(huán)3o次。電泳條帶采用凝膠成像系統(tǒng)分析。
1.2.3四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法比色測(cè)定VSMC增殖率VSMC接種96孔培養(yǎng)板中(每孔1×10個(gè)細(xì)胞)孵育24h，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基24h后棄培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物。2Oh后加入5mg/mIMTT1OL，孵育4h，終止反應(yīng)。棄孔內(nèi)培養(yǎng)液上清液加二甲基亞砜100”L，選擇492nm自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)定各孔吸光度值。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：細(xì)胞增殖率(cellviability)一處理孔AⅢ/x~照孑LA492×100。
1.2.4蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)HO-1及增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心收集上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)法測(cè)蛋白濃度。蛋白(30“g)經(jīng)12十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectroDheresis，SDPAGE)分離后轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidenedifluo—ride，PVDF)膜。5牛血清清蛋白室溫封閉4h，加入一抗4℃過(guò)夜、二抗室溫孵育2h，最后顯像。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均采用i±S表示，采用單因素方差分析，總體有差異兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1大鼠血管平滑肌細(xì)胞鑒定培養(yǎng)的第3代細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，特異性的a—actin在免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，胞漿著色，呈陽(yáng)性反應(yīng)，在鏡下可見胞漿內(nèi)大量棕色、與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，即平滑肌肌動(dòng)蛋白，見封3圖1。
2.2Ox-LDL對(duì)誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VsMC)增殖的影響Ox-LDL呈濃度依賴性(0～150/,g/mL)地誘導(dǎo)VSMC增殖，但是當(dāng)達(dá)到200>g/mi刺激組時(shí)，細(xì)胞數(shù)目減少，提示到達(dá)此濃度可能具備細(xì)胞毒性。各個(gè)濃度刺激組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
2.3姜黃素對(duì)Ox-IDL刺激的VSMCs增殖的影響不同終濃度的姜黃素(40、80/lmol/I)可明顯抑制Ox—LDL(100g/mL)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng)，且呈濃度依賴性;姜黃素(40、80“mot/L)+Ox-IDL組與Ox-LDI單獨(dú)作用組相比，細(xì)胞增殖率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
2.4HO一1抑制劑ZnPPIX對(duì)姜黃素抑制Ox-IDL所誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響給予HO1抑制劑ZnPPⅨ預(yù)處理細(xì)胞后，姜黃素抑制OxLDI所誘導(dǎo)的VSMCs增殖效應(yīng)減弱;姜黃素+ZnPPIX+Ox-IDI組與姜黃素+Ox-LDI組相比，細(xì)胞增殖率增加明顯(P<0.05)，見圖4。
2.5姜黃素對(duì)VSMC的HO一1表達(dá)的影響不同濃度姜黃素組干預(yù)VSMC的H(YlruRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，見封4圖5。2.6姜黃素對(duì)Ox-LDL刺激VSMC的PCNA表達(dá)的影響相比較于空白對(duì)照組，O~LDL可明顯增強(qiáng)PCNA的表達(dá);而姜黃素+Ox-LDI組與Ox-IDL組單獨(dú)作用比較，可明顯抑制PCNA的表達(dá);在加入HO1抑制劑ZnPPⅨ后，姜黃素+OxLDL組的抑制PCNA表達(dá)效應(yīng)可被減弱，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，見封4圖6。
3討論
平滑肌細(xì)胞增殖是AS斑塊形成過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，大量研究表明動(dòng)脈血管壁增厚至斑塊形成是AS病變的主要病理特征。Ox-LDL促進(jìn)AS形成的作用已被大量的研究所證實(shí)。目前認(rèn)為AS形成初期步驟是LDI進(jìn)入內(nèi)皮損傷部位的血管壁，氧化、誘導(dǎo)多種趨化因子，并激活單核細(xì)胞分泌不同的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，刺激平滑肌細(xì)胞遷移、增殖。因此，Ox—IDL在AS中起到關(guān)鍵作用。
HO—l是血紅素降解的起始酶和限速酶，HOl通過(guò)降解血紅素產(chǎn)生一氧化碳(carbonmonoxide，CO)、膽綠素和鐵離子。膽綠素進(jìn)一步經(jīng)膽綠素還原酶作用生成膽紅素，而鐵離子能誘導(dǎo)鐵蛋白的合成_4]。HO一1的這些終產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗血栓的作用;另外，CO和膽色素通過(guò)影響血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和粒細(xì)胞的增殖、遷移和黏附保護(hù)受損動(dòng)脈血管內(nèi)平衡E53。姜黃素是中藥姜黃的主要成分，其抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血栓以及心血管的保護(hù)作用已經(jīng)被證實(shí)l6]。目前已經(jīng)有研究表明姜黃素具有抗細(xì)胞增殖的作用，但是具體機(jī)制還不甚清楚_8_。根據(jù)其眾多藥理作用與HO一1保護(hù)作用相似，姜黃素的相關(guān)保護(hù)作用是否經(jīng)過(guò)HO-1介導(dǎo)值得研究。
本研究結(jié)果顯示，Ox-LDL在一定濃度范圍內(nèi)濃度依賴性地誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，當(dāng)超過(guò)一定濃度，具備細(xì)胞毒性。此實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與Chang等l9的研究結(jié)果相類似，說(shuō)明了OX-LDL對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖影響的特點(diǎn)，其機(jī)制可能是通過(guò)激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂[1。與之類似，Schwer等[1l_也發(fā)現(xiàn)姜黃素HO-1介導(dǎo)抑制胰腺星狀細(xì)胞的增殖由阻遏ERK1/2磷酸化的機(jī)制實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，本組也發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，并且此抑制效應(yīng)可被HO-1的抑制劑ZnPPⅨ部分阻斷。這提示HO—l很可能參與了姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的保護(hù)效應(yīng)。同樣，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在球囊損傷的大鼠模型中，H0—1介導(dǎo)N0抑制大鼠血管平滑肌增殖，從而顯著地抑制了內(nèi)膜增生¨1。為了進(jìn)一步證實(shí)此發(fā)現(xiàn)，本組觀察了姜黃素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞H0—1mRNA和蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著地上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞HO一1mRNA和蛋白表達(dá)。綜上所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示姜黃素抗Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用經(jīng)過(guò)HO-1介導(dǎo)。
PCNA又稱周期蛋白，是一種與細(xì)胞增殖周期有關(guān)的核內(nèi)糖蛋白，是DNA復(fù)制的必需成分，其表達(dá)與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，是使細(xì)胞由靜息期進(jìn)入s期的關(guān)鍵蛋白D33，已成為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項(xiàng)客觀指標(biāo)。本組研究發(fā)現(xiàn)HO一1抑制劑上調(diào)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖細(xì)胞核抗原高表達(dá)，提示HO-1介導(dǎo)的抑制增殖的效應(yīng)可能部分通過(guò)抑制PCNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)。另外研究發(fā)現(xiàn)HO-1的抗增殖效應(yīng)通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子P21_1，P21是細(xì)胞周期素蛋白cdk一2抑制蛋白，cdk_2亦是細(xì)胞周期G和s期調(diào)節(jié)關(guān)鍵。Liu等[15]以含HO一1基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞以劑量依賴方式表達(dá)HO一1mRNA、HO-1蛋白和提高酶的活性，刺激促凋亡基因p53表達(dá)，促進(jìn)VSMCs凋亡而抑制血清刺激的VSMCs增殖。
綜上所述，姜黃素顯著地抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠VSMC增殖，其機(jī)制是由H(9-1介導(dǎo)的PCNA表達(dá)下調(diào)實(shí)現(xiàn)的。這為進(jìn)一步研究姜黃素防治AS提供了一定的理論依掂。
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