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摘 要： 摘要：目的 研究木蝴蝶總黃酮體外抑制肝腫瘤細(xì)胞遷移作用及其可能的作用機(jī)制。方法 本研究應(yīng)用微流控芯片技術(shù)開展木蝴蝶總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響研究，采用RT-PCR、Westernblot法檢測木蝴蝶總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。結(jié)果 微流控芯片
摘要：目的 研究木蝴蝶總黃酮體外抑制肝腫瘤細(xì)胞遷移作用及其可能的作用機(jī)制。方法 本研究應(yīng)用微流控芯片技術(shù)開展木蝴蝶總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響研究，采用RT-PCR、Westernblot法檢測木蝴蝶總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。結(jié)果 微流控芯片結(jié)果顯示，木蝴蝶總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞24h相對(duì)遷移率為16.59%，48h相對(duì)遷移率為8.06%;RT-PCR和Westernblot結(jié)果表明，木蝴蝶總黃酮能降低p38mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05)，能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 木蝴蝶總黃酮在體外具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，其作用機(jī)制可能與減少p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)，即減少p38蛋白的活化有關(guān)。
關(guān)鍵詞：木蝴蝶;總黃酮;肝腫瘤;微流控芯片;細(xì)胞遷移
木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶Orozylumindicum(L.)Vent.的干燥成熟種子，具有清肺利咽，疏肝和胃的功效[1]�？傸S酮類(TF)成分是木蝴蝶的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。微流控芯片(microfluidicchip)具有微量化、超高通量化、集成化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物篩選等領(lǐng)域[5-7]。本研究應(yīng)用微流控芯片技術(shù)研究木蝴蝶總黃酮體外對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，不僅為木蝴蝶作為抗肝腫瘤藥物的研究奠定基礎(chǔ)，也為中藥抗腫瘤藥物的體外藥理學(xué)研究提供新的方法。
1 材料
1.1 儀器
TG-2U型光刻機(jī)(北京中科同志科技有限公司);LSP04-1A精密注射泵(保定蘭格公司);ECLIPSE-TI倒置熒光顯微鏡(日本NIKON公司);RT-PCR(PikoThermol公司);通用電泳儀(美國BD公司);直拉單晶拋光硅片(哈爾濱特博科技有限公司)。
1.2 試藥
木蝴蝶藥材購自大連同仁堂藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為Orozylumindicum(L.)Vent.的干燥成熟種子;木蝴蝶總黃酮(由本實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定純度大于90%)。10%胎牛血清、1%青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);TRlzolReagent(美國Life公司);RIPA裂解液(美國ambion公司);RT-PCR試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司);SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、飛克特超敏ECL發(fā)光液(大連美侖生物科技有限公司);抗體Anti-p38MAPKphosphor(Thr180/Tyr182)(美國Arigo公司);抗體p38MAPK、β-actin(美國Proteintech公司)。
1.3 細(xì)胞株
人肝癌細(xì)胞HepG2，由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫提供。
2 方法
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔日換液、傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.2 藥品的配制
取適量木蝴蝶總黃酮，用DMEM培養(yǎng)液溶解，配制成1.0mg·mL-1含藥培養(yǎng)液，過0.22µm微孔濾膜，4℃保存，備用。
2.3 芯片的設(shè)計(jì)及制作
基于實(shí)驗(yàn)室較為成熟的芯片制作工藝，采用軟光刻法[8-9]制作陽模，采用澆注法[10]將彈性材料PDMS澆注于陽模上形成芯片的閥層及通道層，最后采用氧等離子不可逆鍵合的方法[11]將PDMS結(jié)構(gòu)與載玻片鍵合在一起形成PDMS-玻璃復(fù)合型芯片即“遷移芯片”。該芯片由上至下分別為閥控層，通道層和玻璃層，包括3個(gè)培養(yǎng)液入口，3個(gè)閥控液體入口，2個(gè)細(xì)胞入口，8個(gè)廢液流出口。
2.4 芯片中細(xì)胞培養(yǎng)及給藥
取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，用100μL培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。先通入閥控液體，再通過微量注射器將細(xì)胞從芯片的細(xì)胞注入口注入，37℃培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)12h后使用精密注射泵以0.2µL·min-1的流速向芯片中通入培養(yǎng)液，繼續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)24h。將液閥關(guān)閉，使用精密注射泵以0.2µL·min-1的流速向芯片中通入藥物，給藥作用48h，用顯微鏡在遷移區(qū)域拍照，用IPP軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)[12]，并按照下面公式計(jì)算相對(duì)遷移率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。相對(duì)遷移率(%)=(實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/空白組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。
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2.5 孔板劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞，PBS清洗，0.25%的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁完全。使用1mL槍頭在每組孔底部劃出“一”字形劃痕，然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS清洗3次，設(shè)空白對(duì)照組(加細(xì)胞，但不加藥物)、總黃酮組(TF組，藥物干預(yù)48h)，用顯微鏡在遷移區(qū)域拍照。
2.6PT-PCR法檢測
將處于對(duì)數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞接種在6孔板中，木蝴蝶總黃酮干預(yù)48h后消化收集細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA[13]。應(yīng)用RTPCR試劑盒明書操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA并合成目的基因。引物序列如下：β-actin：F5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，R5'-TTTGATGTCACGCACGATTT-3';p38：F5'-CGGCACACTGATGACGAAAT-3'，R5'-CAACGTTCTTCCGGTCAACA-3'。
2.7Westernblot檢測
取對(duì)數(shù)生長期人肝癌HepG2細(xì)胞接種在6孔板中，木蝴蝶總黃酮干預(yù)48h后消化收集細(xì)胞，加入RIPM、PMSF、磷酸酶抑制劑裂解提取總蛋白。采用NanoDrop5000BSA法測定蛋白濃度，PBS緩沖液調(diào)整使各組蛋白終濃度相同。采用SDS-PAGE法，5%濃縮膠和8%分離膠，在100V電壓下濃縮30min，調(diào)節(jié)電壓120V電泳分離蛋白質(zhì)，在160V電壓下轉(zhuǎn)膜1h，取出PVDF膜用BSA溶液室溫?fù)u床封閉2h。封閉結(jié)束后，將PVDF膜在一抗(5%BSA按照1∶500進(jìn)行稀釋)、二抗(5%BSA按照1∶5000進(jìn)行稀釋)中孵育，TBST搖床清洗，Ecl法進(jìn)行顯色，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值[14]，計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。
2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS19.0和GraphPadPrism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 遷移芯片
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，本課題組設(shè)計(jì)一種用于研究藥物對(duì)細(xì)胞遷移影響的芯片——PDMS-玻璃復(fù)合芯片，設(shè)計(jì)圖及芯片實(shí)物圖見圖1。該芯片包括三層：PDMS閥層，通入液體作為液閥，可控制通道的開合，調(diào)節(jié)細(xì)胞和液體的流向;PDMS通道層，可作為細(xì)胞或液體的通道;玻璃層，用于細(xì)胞貼壁。采用氧等離子不可逆鍵合而成，其中細(xì)胞注入口、藥物注入口、廢液口等位置如圖1所示。
3.2 基于遷移芯片木蝴蝶總黃酮類對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響
如圖2所示，關(guān)閉液閥前，即給藥0h時(shí)，HepG2細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)通道呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，胞質(zhì)透明，生長狀態(tài)良好;關(guān)閉液閥后，細(xì)胞培養(yǎng)腔與相鄰?fù)ǖ老嗤ǎ^續(xù)培養(yǎng)24h后，空白組細(xì)胞向相鄰?fù)ǖ郎L，木蝴蝶總黃酮也有少量細(xì)胞向相鄰?fù)ǖ肋w移生長，但是遷移率較低。木蝴蝶總黃酮組24h、48h相對(duì)遷移率分別為16.59%、8.06%，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明木蝴蝶總黃酮具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。
3.3 基于劃痕實(shí)驗(yàn)的木蝴蝶總黃酮類對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響
如圖3所示，給藥0h時(shí)，各組HepG2細(xì)胞在孔板底部呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，胞質(zhì)透明，生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)24h后，空白組細(xì)胞向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”變小;木蝴蝶總黃酮組部分發(fā)生皺縮，細(xì)胞變圓，但是并未向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”無變化。培養(yǎng)48h后，空白組劃痕空白密布肝癌細(xì)胞，“傷口”幾乎愈合;木蝴蝶總黃酮組細(xì)胞大部分發(fā)生皺縮、變圓，部分細(xì)胞已死亡、懸浮于培養(yǎng)液中，但是并未向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”無變化。說明木蝴蝶總黃酮具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。
3.4木蝴蝶總黃酮對(duì)相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
采用RT-PCR法和Westernblot法檢測相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的變化，由圖4可知，木蝴蝶總黃酮能降低p38mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05)，能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.01)。
4 討論
本研究基于實(shí)驗(yàn)室成熟的芯片制作工藝，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)并制作了用于研究細(xì)胞遷移的微流控芯片，即遷移芯片。該芯片由閥層、通道層、玻璃層組成，閥層和通道層上下對(duì)應(yīng)，該芯片是模擬傳統(tǒng)孔板劃痕遷移實(shí)驗(yàn)。當(dāng)上層閥層中通入液體后，由于壓力的作用，PDMS會(huì)發(fā)生彈性形變，通入液體的通道將下壓，與下層通道層中對(duì)應(yīng)的通道重合，將其與通道層中細(xì)胞流入通道阻斷，即造成“劃痕”，向通道層中細(xì)胞通道通入細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，將液閥關(guān)閉，此時(shí)細(xì)胞與相鄰的通道相連接，細(xì)胞則可向空白通道處遷移生長。防止使用時(shí)通道塌陷，我們在芯片中間加入長橢圓形的支撐結(jié)構(gòu)，使該芯片可重復(fù)多次使用。該芯片通過閥控裝置來模擬“劃痕”，并且這種劃痕不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷，更接近癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程。為了驗(yàn)證該芯片的適用性，本研究同時(shí)使用傳統(tǒng)的劃痕法進(jìn)行驗(yàn)證。劃痕法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與微流控芯片結(jié)果均說明木蝴蝶總黃酮具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。同時(shí)也說明微流控芯片法可以替代孔板內(nèi)進(jìn)行的遷移研究實(shí)驗(yàn)，并存在簡單、快捷的優(yōu)勢。
MAPK即絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase)，是一系列與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)者，包括細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡、存活和耐藥性等[15-16]。p38是MAPK激酶中的一種，據(jù)報(bào)道，p38無論是在人體還是鼠中均與癌癥具有很大的相關(guān)性[17]。Dalasanur等[18]的研究表明，在乳腺癌中激活的p38可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明木蝴蝶總黃酮組能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)，即減少p38的活化，說明木蝴蝶總黃酮能抑制p38活化，抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抗肝腫瘤作用。 綜上所述，本研究結(jié)果表明木蝴蝶總黃酮具有明顯的體外抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與抑制p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)，減少p38的活化有關(guān)。——論文作者：李楠楠1，包永睿1，2，3，4，鄭義博1，王鶴辰1，孟憲生1，2，3，4