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摘 要： 摘要:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種二聚體糖蛋白，能夠誘導(dǎo)毛囊血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，調(diào)節(jié)毛囊周圍毛細(xì)血管生成，進(jìn)而影響毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育。已知cgVEGF164是絨山羊VEGF-A基因的一種主要剪接變體，但cgVEGF164基因是否具
摘要:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種二聚體糖蛋白，能夠誘導(dǎo)毛囊血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，調(diào)節(jié)毛囊周圍毛細(xì)血管生成，進(jìn)而影響毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育。已知cgVEGF164是絨山羊VEGF-A基因的一種主要剪接變體，但cgVEGF164基因是否具有調(diào)控毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的作用目前尚不清楚。為初步探究cgVEGF164基因?qū)γ疑L(zhǎng)的影響及其機(jī)制，本研究通過原核顯微注射制備cgVEGF164轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)小鼠。通過HE染色法比較轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈竺业闹睆胶兔芏龋肳esternBlot檢測(cè)小鼠背部皮膚中信號(hào)蛋白ERK1/2、AKT1、LEF1的磷酸化水平。本研究成功獲得5只陽(yáng)性cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠(雌雄比為4:1，陽(yáng)性率8.5%);與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋D(zhuǎn)基因小鼠毛囊直徑增大、密度增加;經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠中ERK1/2、AKT1、LEF1的磷酸化水平均上調(diào)。結(jié)果表明，cgVEGF164基因具有促進(jìn)小鼠毛囊生長(zhǎng)的作用，推測(cè)該功能可能與cgVEGF164影響ERK1/2、AKT1和LEF1等信號(hào)蛋白的磷酸化有關(guān)。
關(guān)鍵詞:cgVEGF164;轉(zhuǎn)基因小鼠;毛囊生長(zhǎng);磷酸化
毛囊的性狀和結(jié)構(gòu)決定動(dòng)物毛發(fā)的品質(zhì)，研究毛囊生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制對(duì)于提高產(chǎn)絨動(dòng)物產(chǎn)絨量至關(guān)重要。毛囊生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及調(diào)控生長(zhǎng)所需的各類細(xì)胞因子均由其周圍血管(循環(huán)系統(tǒng))提供，因而充足的血液供應(yīng)是毛囊細(xì)胞生長(zhǎng)分化的基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物的毛囊通常呈現(xiàn)周期性變化，包括生長(zhǎng)期、退行期和休止期[1,2]。研究顯示，毛囊周圍的毛細(xì)微血管會(huì)隨著毛囊周期的變化而變化，毛細(xì)微血管在毛囊生長(zhǎng)期比較發(fā)達(dá)，進(jìn)入退行期后逐漸退化[3~5]。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種由二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，能夠促進(jìn)血管再生和調(diào)節(jié)血管滲透性[6,7]。研究證實(shí)，VEGF通過與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)相互作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[8,9]。皮膚中VEGF基因的表達(dá)水平在毛囊生長(zhǎng)期上調(diào)，進(jìn)入退行期后逐漸降低，在休止期則基本消失[4,6]。在小鼠毛囊結(jié)構(gòu)中，VEGF基因主要在外根鞘和毛乳頭中表達(dá)[10]，進(jìn)而誘導(dǎo)毛囊周圍毛細(xì)血管的形成，促進(jìn)外根鞘和毛乳頭細(xì)胞的增殖[11,12]，增大毛囊直徑和毛干長(zhǎng)度[13]。
由于mRNA剪切方式的不同，在人中已發(fā)現(xiàn)7種VEGFmRNA剪接變體，包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF148和VEGF206[14~16]。已知cgVEGF164是絨山羊VEGF-A基因的一種主要剪接變體，在絨山羊腦、心臟、睪丸、胰腺、脾、腎和肺中都有表達(dá)，與人源VEGF165基因的同源性高達(dá)94%[17]。已有研究證實(shí)VEGF165基因能夠促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[18~20]，而cgVEGF164基因是否具有調(diào)控毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的作用目前尚不清楚。本研究旨在通過原核顯微注射法，獲得cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠，比較轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈竺业闹睆胶蛿?shù)量以及相關(guān)信號(hào)蛋白ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平的變化，探討外源基因cgVEGF164對(duì)毛囊生長(zhǎng)的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制，為利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)手段提高產(chǎn)絨動(dòng)物的產(chǎn)絨量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
BDF1雌鼠、CD-1雄鼠、C57小鼠均由內(nèi)蒙古大學(xué)國(guó)家清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育室提供。所有研究符合內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定并授權(quán)。K14-cgVEGF164載體由內(nèi)蒙古大學(xué)王志鋼教授提供[17]，其啟動(dòng)子為Keratin14(K14)，外源基因?yàn)閏gVEGF164。
1.2注射用外源基因的制備
用限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)14-cgVEGF164質(zhì)粒載體進(jìn)行線性化酶切，獲得線性化K14-cgVEGF164質(zhì)粒載體。用乙醇沉淀法對(duì)線性化K14-cgVEGF164質(zhì)粒載體進(jìn)行純化，最后用TE緩沖液溶解并調(diào)整濃度為1.5ng/µL。用分光光度計(jì)測(cè)定OD值，OD值在1.7~1.9之間才可注射。
1.3原核顯微注射
原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠參考文獻(xiàn)[21]中的方法。將6~7周齡性成熟的BDF1母鼠與CD1公鼠合籠，20h后取見栓母鼠的受精卵。將1×10-6µL左右含K14-cgVEGF164質(zhì)粒載體的注射液注入胚胎雄原核，注射完畢后將胚胎移入KSOM培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱。30min后選取25~30枚注射后存活胚胎移入經(jīng)麻醉處理的假孕母鼠輸卵管壺腹部。移植后將假孕母鼠放置于保溫板上待其蘇醒后放回鼠房，懷孕成功母鼠約19天后分娩產(chǎn)仔。
1.4PCR檢測(cè)
根據(jù)K14-cgVEGF164質(zhì)粒載體的序列信息，設(shè)計(jì)一對(duì)用于檢測(cè)外源基因整合的PCR引物。引物信息：
F：5'-CAGGGTCCGATGGGAAAGTGTA-3';
R：5'-TGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGA-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物為675bp，產(chǎn)物橫跨K14啟動(dòng)子和cgVEGF164基因。待出生幼鼠長(zhǎng)至3周時(shí)，剪取約0.5cm尾尖提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，60℃復(fù)性42s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán);最后再72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.5qRT-PCR分析
取10周齡cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)組，保留同窩的陰性小鼠為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M。脫毛后剪取背部皮膚組織，液氮研磨后加入800µLRNAisoPlus，按RNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)合成cDNA。qRT-PCR擴(kuò)增體系為20µL，包括：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10µL，上、下游引物各0.4μL，RoxReferenceDye(50×)0.4µL，ddH2O6.8µL，cDNA2µL。qRT-PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30s;95℃變性10s，60℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。根據(jù)每個(gè)樣品與內(nèi)參基因GAPDH所得的Ct值，利用2-ΔΔCt公式分析目的基因cgVEGF164mRNA的相對(duì)表達(dá)量。目的基因cgVEGF164和內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增引物見表1。
1.6WesternBlot檢測(cè)
取轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笃つw組織，放于1.5mL離心管內(nèi)剪碎，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。封閉后，相應(yīng)一抗(VEGF164ab53465、α-tubulinab15246、ERK1/2ab17942、P-ERK1/2ab50011、AKT1ab32505、P-AKT1ab66138、LEF1ab137872、P-LEF1ab74067均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)4℃孵育過夜，羊抗兔二抗(ab6721購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)室溫孵育1h。最后利用Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光處理。
1.7HE染色與免疫熒光
選取cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟮谋巢拷M織進(jìn)行固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟、蘇木精與伊紅染色。VEGF164一抗(1∶200)過夜孵育，羊抗兔二抗(ab6717購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)(1∶1000)孵育1h進(jìn)行免疫熒光染色。
1.8數(shù)據(jù)分析
cgVEGF164mRNA和VEGF164蛋白的相對(duì)表達(dá)量，毛囊的直徑、密度，ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平等數(shù)據(jù)均以平均數(shù)和平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPadPrism6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)。P>0.05表示沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用“N.S.”(Nosignificance)表示;P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
相關(guān)期刊推薦：《遺傳》雜志是中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所主辦、科學(xué)出版社出版的學(xué)術(shù)期刊，中國(guó)科技核心期刊。本刊的任務(wù)是報(bào)道國(guó)內(nèi)外遺傳學(xué)最新研究成果與進(jìn)展，推動(dòng)學(xué)科進(jìn)步。讀者對(duì)象為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、生命科學(xué)領(lǐng)域的科研、教學(xué)及開發(fā)人員，大學(xué)生、研究生、中學(xué)生物教師等。曾用刊名：遺傳與育種。
2結(jié)果與分析
2.1cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
本研究共移植原核注射胚胎296枚，獲得59只仔鼠，經(jīng)PCR法初步鑒定共獲得5只轉(zhuǎn)基因小鼠(圖1A)，其編號(hào)分別為878號(hào)、890號(hào)、1008號(hào)、1018號(hào)和1021號(hào)，陽(yáng)性率為8.5%。將F0代cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型C57小鼠交配，獲得F1代小鼠。將F1代cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠自交獲得F2代cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠。出生仔鼠用與原代小鼠相同的鑒定方法進(jìn)行鑒定。所有F0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠都能夠?qū)⑼庠椿騻鬟f給子代(表2)。其中1008號(hào)小鼠共獲得6只F2代cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠，其編號(hào)分別為1311、1313、1316、1317、1319和1322(圖1B)。
2.2轉(zhuǎn)基因小鼠cgVEGF164mRNA及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)
利用qRT-PCR、WesternBlot和免疫熒光染色檢測(cè)5只轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笃つwcgVEGF164mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，890、1008、1018、1021號(hào)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠中cgVEGF164mRNA及VEGF164蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于同窩非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈螅?78號(hào)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠中cgVEGF164mRNA及VEGF164蛋白的相對(duì)表達(dá)量與其同窩非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈鬀]有顯著性差異(圖2，A~D)。890號(hào)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠cgVEGF164mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，是同窩對(duì)照小鼠886號(hào)的6.25倍(圖2A);1008號(hào)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠VEGF164蛋白表達(dá)量最高，是同窩對(duì)照小鼠1013號(hào)的1.68倍(圖2，B和C)。經(jīng)免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)VEGF164蛋白主要分布于毛囊球部(圖2D)。
2.3轉(zhuǎn)基因小鼠cgVEGF164mRNA組織表達(dá)譜檢測(cè)及表型分析
為探究cgVEGF164在轉(zhuǎn)基因小鼠各組織中的表達(dá)水平，本研究將1008號(hào)cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠F2代作為實(shí)驗(yàn)組，其同窩的非轉(zhuǎn)基因小鼠作為對(duì)照組，觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠表型的變化，并利用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠各組織中cgVEGF164mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋?周齡cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠的表型無(wú)異常變化，生長(zhǎng)狀況良好(圖3A)。轉(zhuǎn)基因小鼠腦、脂肪、肌肉、肝臟、肺、脾臟、腎臟、心臟、胃、大腸、小腸、睪丸、卵巢等組織中cgVEGF164mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于皮膚組織(圖3B);與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋琧gVEGF164在轉(zhuǎn)基因小鼠腦、脂肪、肌肉、肝臟、肺、脾臟、腎臟、心臟、胃、大腸、小腸、睪丸、卵巢等組織中的表達(dá)量并沒有顯著升高(圖3C)，這可能與K14啟動(dòng)子是表皮特異啟動(dòng)子有關(guān)，表明外源cgVEGF164基因?qū)D(zhuǎn)基因小鼠其他組織的影響比較小。
2.4cgVEGF164基因?qū)π∈竺疑L(zhǎng)的影響
本研究將1008號(hào)cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠F2代作為實(shí)驗(yàn)組，其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠作為對(duì)照組，待小鼠生長(zhǎng)到10周齡時(shí)，將兩組小鼠背部剃毛后，取背部組織制備組織切片，經(jīng)HE染色后觀察。結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋D(zhuǎn)基因小鼠的毛囊直徑明顯增大(圖4A)，毛囊密度顯著升高(圖4B)。轉(zhuǎn)基因小鼠毛囊深入真皮層，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈竺以谡嫫颖容^淺的位置(圖4C)。
2.5VEGF下游信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)
利用WesternBlot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈骎EGF下游蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、AKT1、P-AKT1、LEF1、P-LEF1的相對(duì)表達(dá)量，α-tubulin作為內(nèi)參蛋白，結(jié)果如圖5A所示。通過灰度值計(jì)算P-ERK1/2、P-AKT1、P-LEF1分別占ERK1/2、AKT1、LEF1表達(dá)量的百分比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠中P-ERK1/2/ERK1/2、P-AKT1/AKT1、P-LEF1/LEF1分別為44%、51%、11%，均高于對(duì)照組18%、11%、8%(圖5B)。
3討論
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因整合到動(dòng)物的基因組中，從而使外源基因在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)并且可以穩(wěn)定遺傳[22]。建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，對(duì)研究外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有至關(guān)重要的作用[23,24]。本研究利用原核顯微注射技術(shù)制作cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠模型，旨在研究cgVEGF164基因?qū)π∈竺疑L(zhǎng)的影響。經(jīng)PCR初步鑒定，確定5只小鼠成功轉(zhuǎn)入了cgVEGF164基因(編號(hào)分別是878、890、1008、1018、1021)，陽(yáng)性率為8.5%。經(jīng)qRT-PCR和WesternBlot進(jìn)一步檢測(cè)分析，獲得4只高表達(dá)cgVEGF164的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠(編號(hào)分別是890、1008、1018、1021)。878號(hào)小鼠雖然成功轉(zhuǎn)入了cgVEGF164基因，但其cgVEGF164mRNA和蛋白表達(dá)量不高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈螅茰y(cè)原因可能是由于本研究中構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體屬于隨機(jī)整合載體，外源基因雖然發(fā)生了基因組整合，但其轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)效率將受到整合位點(diǎn)的影響而不可預(yù)測(cè)。由于K14啟動(dòng)子是表皮特異啟動(dòng)子，因而與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋琧gVEGF164基因在轉(zhuǎn)基因小鼠腦、脂肪、肌肉、肝臟、肺、脾臟、腎臟、心臟、胃、大腸、小腸、睪丸、卵巢等組織中的表達(dá)量并沒有顯著升高。
cgVEGF164基因編碼一段由190個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，其N端的26個(gè)氨基酸序列與人源VEGF165的N端完全相同，屬信號(hào)肽序列，推測(cè)該序列與其分泌功能有關(guān)[25,26]。VEGF是血管再生的關(guān)鍵因子，通過促進(jìn)毛囊周圍毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響毛發(fā)生長(zhǎng)和毛囊周期[27]。本研究使用HE染色法對(duì)小鼠背部組織切片進(jìn)行染色觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾萩gVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠毛囊的直徑和密度均增加，毛囊深入真皮層，表明cgVEGF164基因具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。
為進(jìn)一步探究cgVEGF164基因參與小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究通過檢測(cè)信號(hào)蛋白ERK1/2、AKT、LEF1的磷酸化水平初步確定cgVEGF164與MAPK/ERK1/2、PI-3K-AKT1/PAK和Wnt/β-catenin/LEF1等信號(hào)通路的聯(lián)系。ERK1/2、AKT1、LEF1是與VEGF信號(hào)通路相關(guān)的下游信號(hào)蛋白，在促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)毛囊周期中扮演重要角色。ERK1/2是MAPK家族成員之一，參與VEGF調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的增殖[1,12,28,29]。AKT也是MAPK家族成員之一，能夠與VEGFR作用促進(jìn)表皮細(xì)胞的存活和增殖[15,30]。LEF1是Wnt途徑中主要成員之一，與β-catenin蛋白結(jié)合作用于VEGF，調(diào)控毛囊周期促進(jìn)毛發(fā)再生[31~33]。研究結(jié)果顯示，cgVEGF164轉(zhuǎn)基因小鼠背部上皮中ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈螅纱宋覀兺茢郼gVEGF164基因通過促進(jìn)RK1/2、AKT1、LEF1磷酸化調(diào)控毛囊的生長(zhǎng)。但是，毛囊的生長(zhǎng)是多種生物因子綜合作用的結(jié)果，cgVEGF164基因調(diào)控毛囊生長(zhǎng)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。