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摘 要： [摘要]目的：觀察胰高血糖素樣肽一1(GLP一1)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注/細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用并探討其機(jī)制。方法：建立大鼠缺血再灌注模型，分別設(shè)假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(IR)和IR+GLP一1(0.030nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)組，缺血30min后再灌注3h，
[摘要]目的：觀察胰高血糖素樣肽一1(GLP一1)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注/細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用并探討其機(jī)制。方法：建立大鼠缺血再灌注模型，分別設(shè)假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(IR)和IR+GLP一1(0.030nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)組，缺血30min后再灌注3h，Evan'sblue—TYC法檢測(cè)心肌梗死范圍;取左心室游離壁心肌組織，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)測(cè)定心肌組織中氧化一抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(contro1)、單純?nèi)毖鯊?fù)氧組(HR)、HR+GLP一1(1~mol/L、5bcmol/L和10txmol/L)組，電鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡，測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)釋放、SOD活性、MDA含量、活性氧簇(ROS)水平以及線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果：與IR組相比，IR+GLP一1(0.03nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmolfL)組劑量依賴性地減小心肌梗死面積，減輕線粒體超微結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞凋亡，增加SOD活性，減少M(fèi)DA含量(P<0.05或P<0.01);與HR組相比，HR+GLP一1(1t~mol/L、5I~mol/L和10p~moL/L)組劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)HR誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，增加SOD活性，減少M(fèi)DA含量，降低ROS水平，減輕HR誘導(dǎo)的MMP降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：GLP一1可以減輕大鼠心肌缺血再灌注/細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷;其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)心肌抗氧化能力及保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。
[關(guān)鍵詞]胰高血糖素樣肽一1;缺血再灌注損傷;缺氧復(fù)氧;心肌細(xì)胞;抗氧化;線粒體膜電位
胰高血糖素樣肽一l(glucagon—likepeptide一1，GLP一1)又稱為腸促胰島素、類胰升血糖素一1或胰升血糖素樣肽一1。人們對(duì)GLP一1的研究多集中于它在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展以及治療領(lǐng)域的作用上，新近國外研究提出GLP一1對(duì)心肌損傷具有一定的保護(hù)作用。Nikolaidis等研究發(fā)現(xiàn)給予擴(kuò)張性心肌病狗GLP一1后，心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和左心室的收縮功能均有明顯的改善。此外對(duì)心肌梗死病人給予GLP一1也可以改善患者的心功能以及血管成形術(shù)后嚴(yán)重的左心室收縮功能不良J。心肌缺血/再灌注損傷(myocardialischemia—reperfusioninjury，MIRI)是臨床上最為常見的損傷心肌的病理生理過程之一_3J。但是目前國內(nèi)關(guān)于GLP一1對(duì)心肌缺血再灌注損傷作用的研究還相對(duì)較少，其相關(guān)機(jī)制仍尚未闡明。
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本實(shí)驗(yàn)以在體大鼠和體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞為模型，觀察GPL一1對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的線索和思路。
材料和方法
1主要儀器和試劑
健康雄性Sprague—Dawley(so)大鼠及1—3日齡SD乳鼠均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。胰高血糖素樣肽一1(Sigma);兔抗鼠Ot一肌動(dòng)蛋白I抗(北京博奧森);RBITC一羊抗兔Ⅱ抗(solarbio，Spain);超氧化物歧化酶(supemxidedismutase，SOD)測(cè)試盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);膜聯(lián)蛋白V一異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV—FITC/PI)雙染色試劑盒(晶美生物工程有限公司);細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Roche);二氯熒光素二乙酯(DCF—DA，Sigma);線粒體膜電位檢測(cè)試劑(Jc一1，凱基生物科技發(fā)展有限公司)。倒置顯微鏡(NikonTS100);動(dòng)物人工呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司，HX一100E);多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240BD，成都儀器廠);激光掃描共焦顯微鏡(OlympusFV1000);透射電鏡(JEM—CX100)。
2缺血再灌注模型建立
戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定。記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，經(jīng)胸骨左緣第2—3肋間打開胸腔暴露心臟，于左心耳根部下方2mm處用5/o線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，將絲線兩端·859·穿過1根聚乙烯小管，止血鉗夾持細(xì)管，結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗，在Ⅱ?qū)?lián)心電圖見R波明顯增大伴sT段即刻抬高，說明心肌已缺血。30min后予以再灌注，以缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅，相關(guān)導(dǎo)聯(lián)sT段明顯回落為再通標(biāo)志，并持續(xù)3h。
3乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)
取1～3d齡SD大鼠，雌雄不限，開胸取心室肌作原代細(xì)胞培養(yǎng)，差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，48h后更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)3—4d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)情況。針對(duì)胞漿中0【一actin，采用抗一actinI抗與FITC標(biāo)記的熒光Ⅱ抗，免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞。
4心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立
采用Koyama等的方法，配制缺氧液和復(fù)氧液。缺氧液(NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO36.0mmol/L，CaC121.0mmol/L，MgSO41.2mmol/L，乳酸鈉40mmol/L，HEPES20mmol/L，NaC198.5mmol/L，KC110.0mmol/L，pH6.8，37℃)，預(yù)先用高濃度氮?dú)怙柡?>99.9%，1L/min×30min)，測(cè)血?dú)釶O2≤4.0kPa;復(fù)氧液(NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO320mmol/L，CaC121.0mmol/L，MgSO41.2mmol/L，葡萄糖5.5mmol/L，HEPES20mmol/L，NaC1129.5mmol/L，KC15.0mmol/L，pH7.4，37oC)，預(yù)先用純氧飽和(1L/rain×30min)。實(shí)驗(yàn)時(shí)棄去原培養(yǎng)液，用缺氧液漂洗細(xì)胞2次，換預(yù)先經(jīng)高濃度N飽和的缺氧液，培養(yǎng)板置純N持續(xù)通氣的密閉容器中(37℃)3h，再換預(yù)先經(jīng)純氧飽和的復(fù)氧液，以純0復(fù)氧孵育1h(37oC)。
5實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組16只。假手術(shù)組：穿線但不行冠脈結(jié)扎;IR組：開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30min，松解結(jié)扎后再灌注3h;IR+GLP—l組：于缺血再灌注前30min經(jīng)舌靜脈緩慢注入GLP一1(0.03nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)，隨后處理同IR。
乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)3d后，給予缺氧復(fù)氧處理，實(shí)驗(yàn)分為5組：正常對(duì)照組;HR組;HR+GLP一1(1~mol/L、5I~mol/L和10p,mol/L)組：GLP一1預(yù)孵育24h后給予缺氧復(fù)氧處理。
6心肌梗死面積的測(cè)定
大鼠經(jīng)再灌注3h后再次原位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，經(jīng)頸動(dòng)脈注入伊文氏藍(lán)。取出心臟，切片，Trc染色，藍(lán)色為未缺血區(qū)域、紅色為缺血區(qū)域。將紅色的缺血心肌片置于TTC磷酸緩沖液染色。缺血但未梗死心肌染成紅色，梗死心肌則為灰白色，稱量缺血未梗死心肌和梗死心肌濕重。心肌缺血范圍=缺血心肌面積/左心室面積(areaatrisk/eftventriculararea，AAR/LV);心肌梗死范圍=壞死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)面積(necroticarea/areaatrisk，NEC/AAR)
7心肌超微結(jié)構(gòu)觀察
迅速取下心尖部心肌組織切成1mmx1mmx1mm，戊二醛磷酸鹽緩沖液、錢酸各固定2h，脫水、包埋、切片、醋酸雙氧鈾、枸檬酸雙重染色，透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
8心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定
采用TUNEL凋亡試劑盒檢測(cè)各組心肌組織中的凋亡細(xì)胞，激光掃描共焦顯微鏡下觀察，TUNEL陽性細(xì)胞核呈綠色熒光。
9流式細(xì)胞儀檢測(cè)心室肌細(xì)胞的凋亡率0.125%胰蛋白酶制備單細(xì)胞懸液，用AnnexinV-FTTC/P雙染色標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
10心肌氧化、抗氧化物質(zhì)檢測(cè)
再灌注3h結(jié)束后取左心室前壁心肌組織，-70℃冰箱凍存，制備組織勻漿，按試劑盒說明書操作檢測(cè)SOD活性和MDA含量。復(fù)氧1h后收集各組心室肌細(xì)胞培養(yǎng)液，按照乳酸脫氫酶(lactatedehy-drogenase，LDH)，MDA，SOD試劑盒的操作說明測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH，MDA的含量及SOD活性。
11細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)
心肌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平通過使用ROS敏感的熒光探針DCF-DA測(cè)定。細(xì)胞爬片，給予相應(yīng)處理后，DCF-DA染液37℃孵育30min，熒光顯微鏡下隨機(jī)采集5個(gè)不重復(fù)區(qū)。用Image」軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。
12線粒體膜電位檢測(cè)
收集細(xì)胞，加入JC-1溶液(10mg/L)，37℃，5%
co，培養(yǎng)箱孵育15min，清洗，重懸細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞線粒體發(fā)射紅色熒光，同一濾光鏡下呈橙色，細(xì)胞凋亡時(shí)紅色熒光強(qiáng)度減弱，綠色熒光增強(qiáng)，同一濾光鏡下呈綠色。圖像結(jié)果用Image」軟件分析計(jì)算綠色和紅色熒光強(qiáng)度平均值，綠色與紅色熒光強(qiáng)度的比值代表心肌細(xì)胞去極化程度。
13統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xts)表示，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果
1心肌梗死面積
假手術(shù)組心肌缺血范圍為0，IR組與GLP-1+
IR組AAR/LV差異無顯著(P>0.05)，說明實(shí)驗(yàn)操作手法基本一致，排除了由此而造成的誤差。與IR組此較，IR+GLP-1組NEC/AAR明顯下降(P<0.
05)，見表1。
2心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
假手術(shù)組線粒體沿肌絲長軸排列整齊，外膜完整，暗密集，基質(zhì)致密，內(nèi)有電子致密顆粒。胞核呈橢園形，異染色質(zhì)分布均勻。IR組出現(xiàn)廣泛的線粒體損傷，表現(xiàn)為線粒體腫脹，基質(zhì)明顯變淡，嵴排列紊亂。核皺縮，染色質(zhì)凝集。GLP-1預(yù)處理組除部分區(qū)域線粒體有改變外，與對(duì)照無明顯區(qū)別，見圖1.