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摘 要： [摘要]目的：探討轉化生長因子B1(TGF一131)和解整合素金屬蛋白酶33(ADAM33)基因單核苷酸多態(tài)性與兒童哮喘易感性及嚴重程度相關性。方法：采用以醫(yī)院為基礎的病例對照研究(110例哮喘患兒和144例對照)方法，三個多態(tài)性位點(v4、T2、T869C)用聚合酶鏈反應一限制
[摘要]目的：探討轉化生長因子B1(TGF一131)和解整合素金屬蛋白酶33(ADAM33)基因單核苷酸多態(tài)性與兒童哮喘易感性及嚴重程度相關性。方法：采用以醫(yī)院為基礎的病例對照研究(110例哮喘患兒和144例對照)方法，三個多態(tài)性位點(v4、T2、T869C)用聚合酶鏈反應一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術進行基因分型，應用MDR軟件分析基因各位點之間交互作用。結果：TGF一131基因的T869C位點基因型及等位基因頻率分布在哮喘組和對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。哮喘組ADAM33基因V4位點C和位點A等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.01)，而V4位點的CC基因型及位點的GA基因型分布在輕中度哮喘組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，1、2位點的AA基因型分布在重度哮喘與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。MDR交互作用分析顯示，ADAM33基因V4和1、2位點構成的2個位點最佳模型;ADAM33基因位點v4、和TGF·131位點T869C構成的3個位點最佳模型兩組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結論：ADAM33基因V4和位點與兒童哮喘發(fā)生及其嚴重程度相關，同時TGF一131基因T869C位點與ADAM33基因V4和T2位點均具有明顯交互作用
[關鍵詞]轉化生長因子B1;解整合素金屬蛋白酶33;單核苷酸多態(tài)性;基因一基因交互作用
哮喘是兒童最常見的一種慢性呼吸道炎性疾病，其病因和發(fā)病機制涉及到機體免疫、遺傳、神經和環(huán)境等諸多方面。目前大多數(shù)學者認為，在引起哮喘的眾多因素中，遺傳可能是最為重要的因素。TGF-Bl基因是一種具有多功能生物學活性的細胞因子，在調節(jié)細胞外基質代謝、參與炎性反應、間質纖維化和抑制免疫監(jiān)視等方面起重要作用。分子生物學研究表明，TGF.131基因存在多個基因多態(tài)性位點參與哮喘的發(fā)生，但確切機制尚不明了J。ADAM33是首個通過定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因，位于人類染色體20p13，至少包含70個單核苷酸多態(tài)性位點，研究表明該基因具有高度多態(tài)性，在不同的種族，與哮喘的發(fā)生以及氣道高反應性有顯著相關l6]。目前有關TGF.131和ADAM33基因交互作用與漢族兒童哮喘易感性研究尚少見文獻報道。本研究采用以醫(yī)院為基礎的病例一對照方法，應用聚合酶鏈反應一限制性片段長度多態(tài)性，檢測對照組和病例組兒童TGF-B1基因T869C位點和ADAM33基因v4、12位點單核苷酸多態(tài)性，從遺傳流行病學角度探討兩基因的單核苷酸多態(tài)性(Single—nucleotidepolymorphisms，SNPs)與漢族兒童哮喘易感性及嚴重程度的關系，為篩選哮喘的高危人群提供分子流行病學依據(jù)。
1對象與方法
1.1研究對象2008年3月至2010年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內科和兒科住院及門診患兒110例，男6l例，女49例，年齡3.1—14。6歲，符合全球哮喘防治創(chuàng)議的診斷標準，其中輕中度哮喘63例和重度哮喘47例。同時選擇同期住院非呼吸系統(tǒng)疾病患者144例為對照組，對照均無個人及家族哮喘史和過敏史(包括濕疹、過敏性鼻炎、過敏性皮炎)。病例組和對照組問性別構成和平均年齡均無差異，所有研究對象均為來自豫北地區(qū)(河南省黃河以北5市)的漢族兒童，并由家長或監(jiān)護人簽署《知情同意書》。
1.2研究方法
1.2.1基因組DNA提取乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa，)抗凝管采集受檢者外周靜脈血2ml放置一80℃冰箱備用。DNA提取試劑盒購自上海生物工程有限公司，所有操作步驟均按照說明書進行。
1.2.2基因型檢測通過GenBank查找到編號為rs1982073、rs2787094和rs2280090基因完整序列，采用Primerpremier5軟件包設計TGF.B1基因T869C位點和ADAM33基因v4、rI12位點引物，設計的引物由上海生物工程有限公司合成。三位點的引物及PCR反應退火溫度、產物長度及酶切片段見表1。PCR反應總體積25l，其中10×Buffer2.5txl，TaqDNA聚合酶0.7U，dNTP2.5Ixl，上下游引物各1l，TemplateDNA1.5l，25mmol/LMgC121.8l，雙蒸水14l;PCR反應條件：95℃預變性5分鐘;95℃變性30秒，一定的退火溫度30秒，72℃延伸40秒，共35個循環(huán);72~C終延伸1O分鐘，最后4~C保存。取l01PCR產物，建立總體積為301的酶切反應體系，加入相應的限制性酶PstI、HinfI和PvuII(fermentas基因公司)，37oC溫育4小時，65℃水浴15分鐘終止反應，酶切產物用2.O%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5m1)電泳分離，經凝膠成像儀系統(tǒng)處理后進行基因型判讀，記錄并保存結果。
1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計分析。為考察研究資料的可靠性，所有位點每組分別進行Hardy—Weinberg平衡檢驗。組間基因型頻率和等位基因頻率的差異性比較采用檢驗。基因多態(tài)性與哮喘患病風險的關聯(lián)程度采用比值比(OR)及其95%可信區(qū)問(CI)描述。采用MDR(version1.1.0)軟件分析SNP間交互作用。檢驗水準取=0.05。
2結果
2.1樣本的Hardy-Weinberg平衡檢驗三位點在各組的分布均符合Hardy.Weinberg平衡定律，表明本次抽樣具有代表性。TGF一131基因T869C位點對照組(=0.033，P=0.402)，病例組(=1.584，P=0.856);ADAM33基因v4位點對照組(=0.823，P=0.396)，病例組(=0.036，P=0.849);T2位點對照組(=0.703，P=0.402)，病例組(。=1.584，P=0.208)。
2.2TGF一131和ADAM33基因多態(tài)性位點與兒童哮喘相關性分析由表2可見，T869C多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻率在哮喘各組與對照組之間的分布差異均無統(tǒng)計學意義。哮喘各組中V4位點C等位基因頻率均高于對照組(P<0.01)，c等位基因攜帶者患哮喘的危險性是G等位基因的2.36倍(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56)，'I2位點A等位基因頻率在哮喘各組中的分布均高于對照組(P<0.01)，A等位基因攜帶者患哮喘的危險性是G等位基因的2.96倍(OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。V4位點CC基因型分布在對照組與輕中度哮喘組無差異外，余在各組中分布差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);T2位點除GA基因型分布在對照組中國免疫學雜志2o12年第28卷與輕中度哮喘組、AA基因型分布在對照組與重度哮喘組無差異外(P=0.084、0.063)，其余在各組中分布差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.3多態(tài)性位點之間的MDR交互作用分析將數(shù)據(jù)進行交互作用分析，目的在于找出與兒童哮喘發(fā)病顯著相關的基因與基因的交互作用，在一至三階模型中發(fā)現(xiàn)2個位點最佳模型僅包含ADAM33基因位點v4和T2;3個位點最佳模型包括了T869C、V4和。兩模型哮喘組和對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，交叉驗證一致率均為100%。見表3，模型的單元格劃分及組合情況見圖1。
3討論
ADAM33是2002年首個通過定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因，因其與支氣管哮喘密切相關而成為近年來的研究熱點。先后多個研究小組對不同種族人群ADAM33基因單核酸多態(tài)性位點進行了檢測，而研究結果不盡一致，Qu等"研究表明AD.
AM33基因的T+1，TI、V4可能參與了中國北方漢族兒童哮嘴的發(fā)病過程。Nallar等，1則在印第安人群進行的一個病例對照研究中沒有發(fā)現(xiàn)ADAM33基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關性。基于哮喘在具有不同遺傳背景的人群中可能存在不同的哮喘易感基因與各種環(huán)境因素作用而導致哮喘發(fā)生，本研究選擇ADAM33基因V4，T2位點探討中國豫北地區(qū)漢族兒童該基因多態(tài)性和哮喘病的關系。
本組資料結果顯示，哮喘組ADAM33基因v4位點C等位基因和T2位點A等位基因頻率顯著高于對照組，提示C，A等位基因可能增加兒童哮喘的風險(OR=2.36，95%CI=1.56-3.56;OR=2.96，95%Cl=1.78-4.94)，。將哮喘患兒分為輕中度和重度對照研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘組v4位點CC基因型頻率高于對照組，輕中度和重度哮喘組GC基因型頻率高于對照組，表明C等位基因可能同時影響兒童哮喘發(fā)病嚴重程度，當然也有學者得出不同的結論[01，究其原因可能與種族、樣本量大小及環(huán)境暴露因素有關。結果還顯示T2位點GA基因型僅與重度哮喘有關，AA基因型僅與輕中度哮喘有關，而CG基因型可能使哮喘的發(fā)病風險降低，這與Jie等11的研究相一致。本資料提示V4，T2位點多態(tài)性不僅與豫北地區(qū)漢族兒童哮喘的發(fā)生有關而且影響哮喘嚴重程度。
TGF-BI基因T869C位點C置換T后導致蛋白質第10號位置的氨基酸由亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，進而影響到TGF-BI的分泌和表達。文獻資料顯示，TCF-B1能調節(jié)氣道炎癥和加速氣道重塑，增加氣道阻力，影響哮喘發(fā)病過程[2)。也有研究得出相反的結論，Wisniewski等[1)]就未發(fā)現(xiàn)T869C與波蘭人哮喘病的發(fā)生有關。本組資料顯示T869C位點基因型及等位基因頻率在哮喘各組與對照組間均無差異，這表明該多態(tài)性位點與豫北地區(qū)漢族兒童哮喘的發(fā)生及其嚴重程度無明顯相關性。
基因-基因交互作用分析是目前遺傳流行病學研究的熱點問題之一，MDR方法作為一種非參數(shù)、不受遺傳模式影響的分析方法，被成功用于分析多因素相關的復雜疾病研究。雖然TGF一131基因T869C位點基因型在哮喘組和對照組之間分布無差異，經過MDR分析提示，ADAM33基因V4、T2位點與TGF131位點T869C具有明顯交互作用，推測V4、T2、T869C三位點對哮喘發(fā)病可能具有累計效應。哮喘是一種多基因遺傳疾病，發(fā)病機制涉及多條生化通路，單個基因或位點在其發(fā)病中的作用難以得到證實，同時針對多基因多位點的研究可能更具有意義。
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