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摘 要： 摘要：目的采用核殼色譜技術(shù)建立冬蟲夏草中麥角甾醇的快速定量分析方法。方法樣品經(jīng)甲醇超聲提取后，用高效液相色譜測定。色譜柱為Poroshell120SB-C18(30mm4.6mm，2.7m)，流動(dòng)相為甲醇-水(94﹕6)，流速為1mLmin-1，柱溫為35℃，檢測波長為283nm。結(jié)果本方法
摘要：目的采用核殼色譜技術(shù)建立冬蟲夏草中麥角甾醇的快速定量分析方法。方法樣品經(jīng)甲醇超聲提取后，用高效液相色譜測定。色譜柱為Poroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(94﹕6)，流速為1mL·min-1，柱溫為35℃，檢測波長為283nm。結(jié)果本方法可在15min內(nèi)完成冬蟲夏草中麥角甾醇的測定(10min樣品提取和5min色譜分析)。麥角甾醇在7.869~94.43μg·mL-1范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為1.0000;精密度、重復(fù)性良好，RSD均小于3.0%;加樣回收率為97.2%(RSD=3.3%，n=9);對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定。15批不同來源冬蟲夏草的麥角甾醇含量在0.133%~0.279%。結(jié)論建立的色譜分析方法簡便、快速、準(zhǔn)確，有助于提升冬蟲夏草樣品檢測效率。
關(guān)鍵詞：冬蟲夏草;麥角甾醇;核殼色譜柱;高效液相色譜
冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌(Cordycepssinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰的功效[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，冬蟲夏草具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用[3-5]。其主要化學(xué)成分有核苷、多糖、氨糖醇、甾醇和脂肪酸等[6-8]。其中麥角甾醇為真菌類的特征甾醇，也是冬蟲夏草中的重要活性成分之一，具有保護(hù)肝臟、抗纖維化、抑制腫瘤細(xì)胞等作用[9-11]。該成分經(jīng)常被作為冬蟲夏草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，前期研究開發(fā)了多種麥角甾醇含量測定方法，包括紫外分光光度法、薄層掃描法和高效液相色譜法等，其中以高效液相色譜法為主[12-21]。已報(bào)道的高效液相色譜法多采用常規(guī)全多孔填料的反相柱，分析時(shí)間較長(通常在15~30min)[18-21]。核殼色譜技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新型色譜填料技術(shù)，具有柱效高分析速度快和柱壓低應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于多種中藥(如人參、黃芪、珠芽蓼和牛樟芝)的化學(xué)成分的快速液相分析[22-25]。為了提高冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化檢測效率、降低檢測成本，本試驗(yàn)采用核殼色譜技術(shù)建立了快速分析冬蟲夏草中麥角甾醇含量的高效液相色譜法，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)提升提供了科學(xué)依據(jù)。
1儀器、試劑及藥材
1.1儀器
Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);色譜柱AgilentPoroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm);XS205DU型電子分析天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國默克密理博公司);P300H超聲儀(德國ELMA公司);JAC-2010P超聲儀(韓國KODO公司);SBL-22DT超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);Tube-Mill100研磨機(jī)(德國IKA公司)。
1.2對(duì)照品及試劑
麥角甾醇對(duì)照品(含量為96.2%，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110845-201604)。無水甲醇(分析純，成都科隆試劑有限公司，批號(hào)：2020072302)，甲醇(色譜級(jí)，科魯?shù)禄す煞萦邢薰荆?hào)：880602)，水(超純水)。
1.3藥材
共收集15批冬蟲夏草，經(jīng)錢正明博士鑒定為冬蟲夏草。其中S1~S3來自西藏那曲，S4來自青海玉樹，S5~S6來自青海果洛，S7~S10來自四川甘孜，S11~S15來自湖北宜昌。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
Agilent1260型高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentPoroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(94﹕6)，流速為1mL·min-1，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為2μL，檢測波長為283nm，分析時(shí)間5min。理論板數(shù)以麥角甾醇峰計(jì)，應(yīng)不低于2000，主峰與相鄰色譜峰的分離的應(yīng)不小于1.5。
2.2對(duì)照品溶液制備
取麥角甾醇對(duì)照品適量于容量瓶中，精密稱定，加無水甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為314.77μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2mL于20mL容量瓶中，加無水甲醇稀釋成濃度為31.477μg·mL-1的對(duì)照品溶液。
2.3供試品溶液制備
取冬蟲夏草粉末(過三號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，置50mL離心管中，精密加入20mL無水甲醇，密塞，渦旋混勻，超聲處理10min，取出放冷，搖勻，過0.22μm濾膜，即得。
2.4方法學(xué)考察
2.4.1專屬性試驗(yàn)
取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各1份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，色譜結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，空白溶液在麥角甾醇出峰位置無干擾，供試品溶液中麥角甾醇理論板數(shù)為4421，與相鄰色譜峰的分離度為2.2，表明該方法具有良好的專屬性。
2.4.2線性關(guān)系考察
精密量取麥角甾醇對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于容量瓶中，加無水甲醇稀釋，制得濃度分別為7.869，15.74，31.48，47.21，94.43μg·mL-1線性溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。測得線性回歸方程為y=3.0078x-0.2755，相關(guān)系數(shù)r為1.0000，結(jié)果表明麥角甾醇在7.869~94.43μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2.4.3精密度
精密吸取濃度為31.477μg·mL-1對(duì)照品溶液2μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD。測得麥角甾醇的峰面積RSD值為0.27%，表明日內(nèi)精密度良好。精密吸取對(duì)照品溶液2μL，每天測定2次，連續(xù)測定3天，記錄峰面積，計(jì)算RSD。測得麥角甾醇的峰面積RSD值為1.4%，表明日間精密度良好。
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2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批次冬蟲夏草(S11)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。測得6份供試品溶液的麥角甾醇平均含量為0.273%，RSD為2.1%，表明方法的重復(fù)性良好。
2.4.5加樣回收試驗(yàn)
取同一批次已測得麥角甾醇含量的冬蟲夏草(S11)，按3個(gè)取樣量(0.05，0.1，0.15g)分別精密稱定3份，每份樣品均按照1﹕1比例加入對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品加標(biāo)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算麥角甾醇的回收率、平均回收率及RSD，見表1。結(jié)果顯示，9份供試品加標(biāo)溶液的麥角甾醇回收率在93.8%~102.5%，回收率平均值為97.2%，RSD為3.3%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。
2.4.6穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液各1份，在室溫下放置，分別于0，4，8，12，16，20，24h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄麥角甾醇的峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液和供試品溶液中麥角甾醇的峰面積RSD分別為0.64%和1.0%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
2.5樣品含量測定
取冬蟲夏草樣品(S1~S15)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析檢測。采用外標(biāo)法計(jì)算冬蟲夏草中麥角甾醇的含量，結(jié)果見表2。15批不同來源的冬蟲夏草中麥角甾醇含量在0.133%~0.279%。
3討論
3.1提取條件優(yōu)化
麥角甾醇為脂溶性成分，文獻(xiàn)多采用甲醇、乙醇，加熱回流或超聲處理的方式提取，提取時(shí)間通常為30~60min[15-21]。本研究在文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，選擇了甲醇作為提取溶劑，為實(shí)現(xiàn)多批次樣品同時(shí)提取，選用了超聲處理的方式。當(dāng)料液比1﹕100，超聲時(shí)間為60min時(shí)，提取1次、2次、3次，測得麥角甾醇的含量無明顯差異，說明超聲提取60min可確保冬蟲夏草中的麥角甾醇提取完全。以超聲60min時(shí)的麥角甾醇提取率為100%，超聲1，5，10，20，30，40min，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到10min，提取效率均在95%以上，因此選擇10min作為提取時(shí)間。本文還考察了料液比對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)料液比1﹕50，超聲10min時(shí)，提取率未達(dá)到95%。為兼顧提取效率和提取效果，本研究選擇甲醇為提取溶劑，1﹕100的料液比，超聲處理10min作為最佳提取條件。
3.2色譜條件優(yōu)化
前期關(guān)于蟲草類產(chǎn)品中麥角甾醇的定量分析多采用5μm粒徑的全多孔反向色譜柱，分析時(shí)間較長通常在15~30min[18-21]。核殼型色譜柱的填料也稱為表面多孔型填料，其結(jié)構(gòu)由實(shí)心內(nèi)核和多孔殼外層組成。近年來，已有許多研究者將核殼型色譜柱運(yùn)用到中藥的快速分析領(lǐng)域。本文采用亞3μm粒徑的核殼型色譜柱，參考文獻(xiàn)選擇了甲醇-水作為流動(dòng)相，經(jīng)考察，使用94%甲醇等度洗脫，可在5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草中麥角甾醇的分離分析。比較了不同品牌的色譜柱(AgilentPoroshell120SB-C18、WatersCortecsC18、ACEUltraCoreSuperC18)，麥角甾醇與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，分離效果均良好。
3.3樣品分析
本文所建立的分析方法在15min內(nèi)即可完成樣品的提取和分析，對(duì)15批不同來源的冬蟲夏草樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示麥角甾醇的含量在0.133%~0.279%，平均含量在(0.212±0.040)%。過立農(nóng)等[15]建立的色譜分析方法需要45min完成冬蟲夏草樣品麥角甾醇含量的測定，27批樣品的麥角甾醇含量在0.0288%~0.173%，平均含量在(0.116±0.039)%;張薇薇等[21]報(bào)道的方法耗時(shí)50min以上，11批冬蟲夏草樣品的麥角甾醇含量在0.0018%~0.497%，平均含量在(0.172±0.164)%。為了進(jìn)一步對(duì)新建立分析方法和已報(bào)道文獻(xiàn)方法進(jìn)行比較，采用文獻(xiàn)報(bào)道方法[18]和新建立分析方法對(duì)冬蟲夏草樣品(S11)進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示2種分析方法測得樣品中麥角甾醇的含量分別為(0.270±0.001)%和(0.271±0.001)%，測定結(jié)果基本一致;新建立分析方法所用測定時(shí)間(15min)僅為文獻(xiàn)報(bào)道方法(85min)的1/5不到。
綜上所述，本文所建立的測定冬蟲夏草中麥角甾醇的分析方法，在15min內(nèi)可以完成樣品的提取(10min)和色譜分析(5min)，并且樣品測定結(jié)果和前期報(bào)道方法結(jié)果一致。該方法具有操作簡便、分析快速、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于冬蟲夏草的產(chǎn)業(yè)化分析檢測，為冬蟲夏草質(zhì)量評(píng)價(jià)提升提供了依據(jù)——論文作者：周妙霞1，莊詩詩1，李文慶1，汪小東1，楊豐慶2*，錢正明3*