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摘 要： 摘要目的：研究大蒜素對胃癌細胞SGC.7901生長的抑制及其機制。方法：應用MTr、RTPCR及Westernblot等方法觀察細胞形態、P38及Caspase一3蛋白及基因的表達情況。結果：(1)大蒜素抑制細胞生長、凋亡細胞增多(P0.05)。(2)大蒜素作用下胃癌細胞p-P38、Caspase一3
摘要目的：研究大蒜素對胃癌細胞SGC.7901生長的抑制及其機制。方法：應用MTr、RT—PCR及Westernblot等方法觀察細胞形態、P38及Caspase一3蛋白及基因的表達情況。結果：(1)大蒜素抑制細胞生長、凋亡細胞增多(P<0.05)。(2)大蒜素作用下胃癌細胞p-P38、Caspase一3表達量增加(P<0.05)。結論：大蒜素能抑制胃癌細胞增殖.誘導凋亡。
關鍵詞胃腫瘤;大蒜素;凋亡
胃癌在全球發病率高，死亡率在惡性腫瘤中居第二。五年生存率仍僅為7%～14%，因此尋找新的治療靶點對于胃癌的防治具有重要的意義…。實驗發現大蒜素通過直接殺傷腫瘤細胞及調節機體免疫功能兩個方面干擾腫瘤細胞生長進而抑制腫瘤的發生[。本實驗通過觀察大蒜素對胃癌細胞株SGC一7901生長及凋亡的影響，探討對胃癌生長抑制及促進其凋亡的可能作用機制。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細胞株及實驗材料胃癌SGC.7901細胞株(中國科學院上海生命科學研究院);大蒜素(山東魯抗辰欣藥業有限公司);RPMI.1640(美國Gibco公司);Hoechst染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);Trizol試劑盒(美國Gibco公司);逆轉錄試劑盒(日本Takara公司);兔抗人P—p38抗體(CellSignaling公司);兔抗人Caspase.3抗體(abeam公司);二抗(美國Bioworld公司)。
1.1.2引物根據Genebank資料庫.應用premiers5.0軟件設計和確定最優引物。然后經Blast匹對，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1細胞培養人胃癌細胞SGC.7901在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養.用0.25%胰蛋白酶消化傳代，37℃、5%CO：、95%濕度條件下的培養箱中常規培養，取對數生長期細胞進行實驗。
1.2.2實驗分組將細胞分為3組：(1)空白組;(2)對照組：含培養細胞，不加藥物干預;(3)大蒜素作用組：含培養細胞，藥物作用終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0~zg/mL亞組。以上每組均設4個平行孑L。
1.2.3MTT法測定細胞生長抑制率收集對數生長期的細胞.以10eells/~L的密度鋪于96孔板，培養24h后，加入不同濃度，繼續培養48h，棄去培養液，加入無血清培養液100L/孔，MTT20~L/：fL，培養4h后加人二甲基亞砜150L/孔，振蕩10min，490nm波長測定吸收值。抑制率=(A對照組一A藥物組)/a對照組×100%。繪制抑制曲線，計算藥物半數抑制率(IC50)。
1.2.4Western.Blot檢測蛋白，表達、RT.PCR檢測基因表達細胞鋪24孔板24h后，按設定濃度加入大蒜素，每一濃度組4孔。培養72h后移去上清，直接裂解、收集細胞。提取總蛋白，Westernblotting法檢測p.P38MAPK、Caspase.3蛋白水平。以Tubulin作為內參AlphaEaseFC4.0圖像分析軟件進行分析。提取總RNA，RT—PCR檢測P38MAPK、Caspase-3mRNA的表達水平。
1-3統計學分析采用SPSS16.0統計軟件分析。計數資料用±S表示。兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。組間比較采用單因素方差分析。P<0.O5認為差異有統計學意義。
2結果
2.1大蒜素抑制胃癌細胞SGC.7901增殖MTT檢測顯示大蒜素能夠顯著抑制細胞增殖，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸增加，呈現濃度和時間依賴性。2.5～40.0~g/mL不同濃度大蒜素作用SGC.7901細胞株24h，對SGC.7901細胞的增殖抑制率從2.43%升高到67.38%。與對照組相比.除2.5~g/mL組差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。作用48h，對細胞的增殖抑制率從4.42%升高到79.9l%。與對照組相比。各組差異均有統計學意義(P<0.05)。作用72h，細胞的增殖抑制率從7.23%升高到91.35%。與對照組相比，各組差異均有統計學意義(P<0.05)。而低濃度2.5p~g/mL大蒜素作用SGC一7901細胞株24、48、72h的抑制率從2.43%遞增到7.23%：高濃度40.0~g/mL大蒜素作用SGC.7901細胞株24、48、72h的抑制率從67.38%遞增到91.35%(表1)。
2.2細胞形態學觀察光鏡觀察：對照組腫瘤細胞密度高，布滿整個觀察視野，細胞增殖旺盛，部分細胞因生長擁擠漂浮，細胞貼壁性好，胞漿豐富且分布均勻，胞核大、深染，核周有凹陷性切跡，核分裂像多見;隨著藥物作用濃度的提高(2.5～10.0p~g/mL)，細胞數量逐漸減少，貼壁性減弱，細胞質中顆粒增多，細胞透亮度降低，細胞之間間隙加大.細胞膜邊緣毛糙;20.0、40.0~g/mL大蒜素作用72h后，細胞數量明顯減少，密度減低，貼壁性差，大部分細胞漂浮、死亡，細胞形態變得不規則，細胞之間間隙加大，細胞質中空泡增多明顯，細胞膜邊緣毛糙明顯，核漿比例下降，核分裂像少見。
2.3RT.PCR檢測P38及Caspase.3mRNA表達情況不同濃度大蒜素作用于胃癌SGC一7901細胞72h后.以Trizol法提取細胞總RNA，進行RTPCR半定量檢測，結果如圖1，并對其進行半定量分析，基因半定量分析顯示：2.5—4O.0~xg/mL不同濃度大蒜素作用SGC.7901細胞株72h后，其Caspase一3/GAPDH值從0.223升高到1.131，與對照組相比，差異具有顯著性，不同濃度之間亦有顯著性差異(P<0.01);P38/GAPDH值從0.252升高到0.881，與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。
可發現不同濃度大蒜素作用SGC一7901細胞株72h后。P38/GAPDH與Caspase一3/GAPDH比值均隨著濃度增高而逐漸升高，與對照組相比，差異有統計學意義。由此可見：大蒜素作用于胃癌SGC一7901細胞可顯著增強細胞中P38及Caspase.3mRNA的表達.并且隨著藥物濃度的增加而增加，呈現濃度依賴性。
2.4WseternBlot檢測p-P38及Caspase.3蛋白表達情況大蒜素以不同的濃度作用于胃癌SGC7901細胞72h后.對細胞進行Westernblot的檢測.結果如圖2所示用ImageJ軟件對WesternBlot結果進行分析，并將所得數據通過SPSS16.0進行統計學分析.單因素方差分析結果顯示，不同濃度大蒜素誘導下P—P38及Caspase一3蛋白表達量的相對值(與Tubulin的比值)隨著大蒜素濃度的升高而升高(P<0.05)，與基因表達情況相似均呈現濃度依賴性
3討論
經典的細胞凋亡信號傳導通路有以下3條]：(1)死亡受體通路，以Fas/FasL通路為代表。(2)內質網通路。(3)線粒體通路，引起下游Caspase級聯反應。以上3條通路最后均通過Caspase共同通路介導細胞凋亡。而Caspase一3作為Caspase家族成員功能相對較明確的凋亡效應分子，在細胞凋亡中發揮關鍵作用。P38MAPK信號傳導通路是MAPK通路的分支之一，其在炎癥、應激、凋亡、細胞周期和生長的多種生理和病理過程中發揮著重要作用l7_，而且可能是潛在的腫瘤治療的靶目標有研究表明P38MAPK激活會導致Caspase一3表達增加從而促進凋亡[1o]。本實驗通過觀察不同濃度大蒜素對胃癌細胞生長及凋亡的影響，發現P38、Caspase.3mRNA及蛋白表達均隨著大蒜素濃度增加而增加，大蒜素能夠誘發胃癌細胞凋亡，隨著作用濃度的增加或作用時間的延長.胃癌細胞凋亡增多。由此我們推斷，大蒜素通過增加P38基因的表達，進而激活P38MAPK途徑的信號表達，進而增加Caspase.3的表達，從而引起Caspase.3級聯反應，抑制細胞生長，促進細胞凋亡。然而，究竟大蒜素是通過P38表達的增加調節Caspase.3表達的變化。亦或是直接調節P38及Caspase.3表達我們尚無法界定，因此在下一步實驗中我們會對P38進行阻斷，從而明確兩者之間的聯系。
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綜上所述，本實驗的研究結果表明，大蒜素能夠抑制胃癌細胞SGC.7901的增殖，誘發凋亡，其機制與Caspase.3的表達增加相關。由此提示P38MAPK/Caspase.3途徑在調控胃癌細胞凋亡方面的作用，從而為抗腫瘤治療提供一個新的思路。但是大蒜素激活P38，進而激活Caspase途徑的具體方式尚未深人探討，還需進一步的研究